Spremljanje izražanja označevalcev avtofagije LC3 in p62 v celicah HEK293T, HeLa in fibroblastihKristanc, Pia (Avtor) Dolinar, Marko (Mentor) Tavčar Verdev, Petra (Komentor) avtofagijaLC3p62imunodetekcijaAvtofagija je eden ključnih celičnih procesov, odgovornih za ohranjanje homeostaze znotraj celice. Avtofagija je inducirana v primeru pomanjkanja hranilnih snovi, kopičenja agregiranih proteinov, nedelujočih organelov, prisotnosti eksogenih patogenov, stresa itd. Med avtofagijo pride do razgradnje zajetega tovora (proteinov, nedelujočih mitohondrijev in drugih organelov …) v veziklu, imenovanem avtolizosom, in sprostitve makromolekul v citoplazmo, kjer se lahko znova porabijo v anabolnih procesih. Potek avtofagije lahko med drugim spremljamo preko dveh označevalcev, LC3 in p62. LC3 je transmembranski protein, ki se nahaja v membrani avtofagosoma in se tekom avtofagije spremeni iz oblike LC3-I v LC3-II. Oblika LC3-II je lipidirana. p62 je protein, ki veže tovor, namenjen razgradnji z avtofagijo, in se zasidra v notranjo membrano avtofagosoma. Za raziskave avtofagne aktivnosti se uporabljajo tudi induktorji, kot sta rapamicin in stradanje, ter inhibitorji razgradnje, kot sta bafilomicin A1 in klorokin. Avtofagijo smo poskusili inducirati z dodatkom rapamicina in s stradanjem z uporabo gojišča EBSS. Za inhibicijo razgradnje v zadnjem koraku avtofagije smo uporabili bafilomicin A1 in različne koncentracije klorokina. Obdelave smo pustili delovati različno dolgo. Preizkusili smo dva različna lizna pufra, RIPA in 2-kratni pufer z NaDS in reducentom, prenos western pa smo izvajali z uporabo prenašalnega pufra z 10-% ali 20-% metanolom in na nitrocelulozno membrano ali membrano PVDF. S primerjavo svežih in zmrznjenih celičnih lizatov smo preverili vpliv zamrzovanja na količino izbranih avtofagnih označevalcev. Izkazalo se je, da najboljše rezultate dobimo ob uporabi rapamicina kot induktorja in 100 μM klorokina kot inhibitorja. 2-kratni lizni pufer z NaDS in reducentom se obnese bolje kot RIPA in za analize so bolj primerni sveži kot zmrznjeni lizati. Prenos na membrano je bolj učinkovit pri uporabi prenašalnega pufra z 20-% metanolom in membrane PVDF. Fibroblasti izražajo relativno največje količine obeh označevalcev, celice HEK293T pa so najbolj primerne za vzpostavljanje protokola in preliminarne poskuse.20252025-07-03 12:50:01Diplomsko delo/naloga170314sl