Vzpostavitev in vitro sistema za preučevanje vloge RNA pri procesu ločitve tekočih faz z RNA-oligonukleotidi Efl, Sulf in WdrKogoj, Lena (Avtor) Plavec, Janez (Mentor) biomolekulski kondenzatiproces ločitve tekočih fazsvetlobna mikroskopijaUV-Vis spektroskopijaNemembranski organeli ali biomolekulski kondenzati, na primer jedrce in stresne granule, nastanejo s procesom ločitve tekočih faz (LLPS). V celicah opravljajo zelo pomembne funkcije, nepravilnosti v zvezi z njihovim delovanjem pa vodijo v bolezni, kot so nevrodegenerativne bolezni, določene vrste raka, virusne okužbe in dilativna kardiomiopatija, zato se znanost njihovemu raziskovanju v zadnjem času intenzivno posveča. V svoji diplomski nalogi se osredotočam na biomolekulske kondenzate, ki so ključni pri diferenciaciji naivnih mišjih embrionalnih matičnih celic, njihovo središče pa predstavljajo dolge nekodirajoče RNA Efl1, Sulf2 in Wdr62. Namen diplomskega dela je vzpostaviti in vitro rekonstituiran sistem, ki bi omogočil strukturne študije LLPS z NMR-spektroskopijo. Z bioinformatsko analizo smo na podlagi napovedi sekundarne strukture izbrali kratka oligonukleotidna zaporedja Efl, Sulf in Wdr, izvirajoča iz dolgih nekodirajočih RNA Efl1, Sulf2 in Wdr62. Poliakrilamidna gelska elektroforeza (PAGE) pod nativnimi pogoji in NMR-spektroskopija sta nam pokazali, da so oligonukleotidi v kislem in nevtralnem pH v nerazviti obliki, kar pomeni, da LLPS ne more poteči na osnovi interakcij med strukturnimi elementi RNA. S testi turbidnosti in svetlobno mikroskopijo smo določili, da kombinacije RNA oligonukleotidov, peptidov in različnih soli v večini primerov vodijo v agregacijo. Kljub temu nam je uspelo najti pogoje za potek LLPS, in sicer pri pogojih 20-75 µM RNA, 150-200 µM RNA-prepoznavnega motiva 3 proteina PTBP1, 3-5 mM Mg$^{2+}$ in 10-% masnega deleža PEG. Vpliva pH in Na$^+$ oziroma K$^+$ ionov na potek LLPS nismo opazili. Identiteto kapljic smo potrdili s testom raztapljanja s povečevanjem ionske moči. V povsem novem makromolekulskem sistemu smo tako našli pogoje, pri katerih poteče LLPS, pri čemer smo identificirali vplive različnih dejavnikov na stanje v sistemu. Stabilnost in ponovljivost vzpostavitve preučevanega sistema nam bosta omogočili strukturno analizo z NMR-spektroskopijo, ki bo dala pomemben uvid v nastanek in delovanje biomolekulskih kondenzatov, vključenih v embrionalni razvoj.20252025-07-02 15:15:12Diplomsko delo/naloga170202sl