Načrtovanje sintezne vnetne poti receptorja STING z uporabo oligomerizacijskih domenBabnik, Ana (Avtor) Hafner Bratkovič, Iva (Mentor) Župunski, Vera (Komentor) STINGIRF3NFκBsintezna vnetna napravaimunoterapija rakaSTING je adaptorski protein signalne poti cGAS-STING, ki je del prirojene imunosti. Receptor cGAS prepozna citosolno DNA, ki izvira iz okužb s patogeni ali poškodb lastnih celic, in preko aktivacije STING sproži sproščanje IFN tipa I in provnetnih citokinov, kar izzove imunski odziv. Signalna pot cGAS-STING ima zaradi aktivacije imunskih celic pomembno vlogo v ustvarjanju protitumorskega imunskega odziva, zaradi česar je privlačna tarča za imunoterapijo raka. Razvili so že več agonistov STING, ki pa lahko ob vnosu v telo sprožijo sistemsko vnetje, zaradi česar so potrebni novi pristopi. Eden izmed pristopov je uporaba umetnih sistemov, ki imajo prednost v tem, da niso odvisni od prisotnosti funkcionalnih poti ter ob primerni dostavi omogočajo lokalno in omejeno aktivacijo. Želeli smo pripraviti t.i. vnetno napravo na osnovi segmenta STING, ki bi izboljšala aktivacijo IRF3 in NFκB. Uporabili smo himerni CTT iz človeka in navadne cebrice, za katerega so de Oliveira Mann in sodelavci pokazali, da vzpodbudi signalizacijo preko obeh transkripcijskih faktorjev. Za izboljšanje signaliziranja smo ubrali različne pristope: pripravili smo konstrukte CTT z različnim številom ponovitev CTT, z dodatkom oligomerizacijskih domen in TDP-43, ki tvori kondenzate preko fazne ločitve, s čimer smo posnemali oligomerizacijo STING na membrani endoplazemskega retikuluma ali Golgijevega aparata. Za analizo vpliva konstruktov na učinkovitost aktivacije IRF3 in NFκB smo konstrukte vnesli v celično linijo HEK293T. Ugotovili smo, da sta za ojačitev aktivacije transkripcijskih faktorjev v konstruktu s CTT potrebna TDP-43 in dodatek oligomerizacijskih domen oziroma TDP-43 in večje število ponovitev CTT. Najučinkovitejši sta bili različici, kjer je bil CTT vezan na protein TDP-43 v kombinaciji s tetramerizacijsko domeno in kjer so bile na TDP-43 vezane tri zaporedne ponovitve CTT. Omenjena konstrukta sta tudi v rakavi celični liniji HeLa aktivirala transkripcijski poti IRF3 in NFκB. V okviru magistrskega dela smo uspešno pripravili konstrukte na osnovi STING, s potencialom za obetaven in inovativen pristop pri imunoterapiji raka, ki ne temelji na izražanju endogenih komponent signalne poti cGAS-STING v rakastih celicah.20252025-07-02 15:14:51Magistrsko delo/naloga170200sl