Dislipidemija pri s presnovo povezanih boleznih jeter ter bolnikih s COVID-19Kočar, Eva (Avtor) Rozman, Damjana (Mentor) MASLDCOVID-19SARS-CoV-2dislipidemijabiosinteza holesterolasterolistrojno učenjebiooznačevalciS presnovno motnjo povezana steatotična bolezen jeter (MASLD) je najbolj razširjena oblika kronične bolezni jeter na svetu. MASLD je tesno povezana z dislipidemijo, vendar nepopolno razumevanje molekularnih mehanizmov bolezni otežuje napoved poteka bolezni ter razvoj učinkovitih diagnostičnih in terapevtskih pristopov. Dislipidemija se pojavlja tudi pri bolnikih s COVID-19, pri čemer je njen obseg povezan z napredovanjem in izidom bolezni. Zaradi visoke zdravstvene in ekonomske obremenitve, ki jo povzročata MASLD in COVID-19, je iskanje novih biooznačevalcev posamezne bolezni izjemno pomembno. Osrednji namen doktorskega dela je bila opredelitev potencialnih tkivnih in krvnih biooznačevalcev različnih stopenj fibroze MASLD ter napredovanja in poteka bolezni COVID-19. Posvetlili smo se tudi preučevanju vpliva prekinjene biosinteze holesterola na sterolno sestavo membran in vezavo virusa SARS-CoV-2 na membrane celic gostitelja. Z analizo transkriptoma 60 vzorcev jeter bolnikov z različnimi stopnjami fibroze MASLD smo med skupinami opredelili devet diferenčno izraženih genov (AEBP1, ANKRD29, CPE, EFEMP1, ITGBL1, LUM, PTGDS, A2M, TRIM22). Na podlagi dodatnih računskih analiz ter pregleda objavljene literature smo razširili nabor tarčnih genov ter z metodo RT-qPCR na večji kohorti pacientov (N=141) eksperimentalno potrdili diferenčno izražanje 17 od skupno 27 genov. Poleg tega smo s tehnikami strojnega učenja zgradili klasifikacijski model, ki na podlagi treh kliničnih parametrov (indeks telesne mase, celokupni holesterol, število trombocitov) ter izražanju osmih genov (LUM, PTGDS, FBLN5, DPT, EFEMP1, STMN2, DCN, MMP2) razvrsti bolnike z začetnimi stopnjami fibroze MASLD (F0–F1/F2; AUC=0,84). S tarčno lipidomiko smo določili sterolni profil v serumu 62 hospitaliziranih bolnikov s COVID-19 ter podali vpogled v sterolne intermediate, predhodnike holesterola, med boleznijo COVID-19. Prišli smo do ugotovitve, da je biosinteza holesterola med potekom bolezni spremenjena. V primerjavi s pacienti, ki so imeli blag potek bolezni, so bile pri pacientih s hudim potekom COVID-19 spremembe izrazitejše, saj so bile statistično značilno spremenjene koncentracije večih sterolnih intermediatov (cimostenol, cimosterol, 24-dehidrolatosterol, dezmosterol, holesterol). S tehnikami strojnega učenja smo zgradili klasifikacijski model (N=164), ki presega obstoječe klinične ocene tveganja. Razvit model temelji na osmih lahko dostopnih kliničnih parametrih in z izjemno natančnostjo napove potek bolezni COVID-19 (AUC=0,96). Vključitev meritev podskupine sterolnih intermediatov izboljša občutljivost modela. Vpliv prekinjene biosinteze holesterola na sterolno sestavo membran in na vezavo proteina spike z membranami smo preučevali na modelnih celičnih linijah HepG2 z izbitimi geni za encime iz poskvalenskega dela biosinteze holesterola. Z metodama LC-MS/MS in konfokalno mikroskopijo smo pokazali, da prekinjena biosinteza holesterola vpliva na sterolno sestavo preučevanih celic ter na specifično vezavo fluorescenčne različice ostreolizina A6 na lipidne rafte. Za preučevanje vezave virusnega proteina spike z membrano smo z metodama rekombinantne DNA in afinitetne kromatografije uspešno izrazili in očistili receptorvezavno domeno (RBD) virusnega proteina spike. Pokazali smo, da se izražanje receptorja ACE2 med celičnimi linijami HepG2 različnih genotipov razlikuje, vendar vpliva prekinjene biosinteze holesterola na vezavo RBD-spike z membranami celic HepG2 različnih genotipov nismo uspeli potrditi. Raziskava je identificirala nove potencialne tkivne biooznačevalce posameznih stopenj fibroze MASLD in podala izhodišče za odkrivanje neinvazivnih biooznačevalcev bolezni v krvi. Prav tako je opredelila spremembe sterolnega profila v serumu hospitaliziranih bolnikov s COVID-19 ter izpostavila biooznačevalce poteka bolezni. Nenazadnje pa je raziskava podala tudi smernice za nadaljnje preučevanje vpliva prekinjene biosinteze holesterola na vezavo in vstop virusa SARS-CoV-2 v celice gostitelja.20252025-05-16 10:08:53Doktorsko delo/naloga169186sl