Načrtovane visokomolekularne proteinske nanostrukture za predstavitev funkcionalnih proteinskih domenMezgec, Klemen (Avtor) Gradišar, Helena (Mentor) Jerala, Roman (Komentor) Cirkularna permutacijatitinspektrinske ponovitvedistrofinproteinski inženiringovite vijačnicesamo-sestavljanje proteinovproteinska vlaknabiomaterialinastavljiv razmikProteinski inženiring modularnih gradnikov predstavlja zmogljiv pristop za izdelavo načrtovanih visokomolekularnih struktur in naprednih biomaterialov z nanometrsko natančnostjo. Kljub hitremu napredku računalniških metod strojnega učenja za načrtovanje proteinov oziroma topološko opredeljenih proteinskih kompleksov ostaja izdelava umetnih struktur, ki posnemajo naravno arhitekturno ureditev velik izziv. Navdih za delo smo črpali iz človeških mišičnih proteinov, ki zavzemajo značilno topologijo enodimenzionalnih (1D), linearnih vlaken in so ključna za zagotavljanje strukturne integritete in mehano-elastičnih lastnosti mišičnega tkiva. Iz tega razloga smo se osredotočili na razvoj modularnih gradnikov, ki temeljijo na osnovi ß-globularnih imunoglobulinskih in ?-vijačnih spektrinskih ponovitev iz titina oziroma distrofina. Prva izmed zasnovanih strategij temelji na vpeljavi cirkularne permutacije (CP) v ß-globularne titinske domene. Modificiranim gradnikom omogoča vzpostavitev nativnih interakcij med prestavljenim trakom ß in izpostavljenim grebenom ß-ploskve ter posledično sposobnost usmerjenega samo-sestavljanja v nitaste visokomolekularne strukture s primerljivo topološko ureditvijo kot jo lahko najdemo v naravnem titinu. Zaradi težav z robustnostjo tehnologije smo se z enakim ciljem posnemanja naravne arhitekture osredotočili na distrofin, ki je zgrajen iz številnih tandemskih ponovitev spektrinskih modulov. Vsak modul je sestavljen iz svežnja treh ?-vijačnic, kjer sta N- in C-konca locirana na nasprotnih straneh proteinske domene. Z vpeljavo pristopov proteinskega načrtovanja smo zasnovali nabor ortogonalnih gradnikov iz spektrinskih ponovitev in načrtovanih peptidov, ki tvorijo povezovalne motive ovitih vijačnic (OV). Peptide smo v gradnike vključili na način, da so ohranili kontinuiteto N- in/ali C-končnih spektrinskih ?-vijačnic ter tako omogočili izgradnjo iztegnjenih visokomolekularnih struktur v obliki vlaken. Na več načinov smo pokazali, da z zasnovano strategijo lahko pripravimo rekombinantna spektrinska vlakna, ki se nato združijo v robustne večmikrometrske snope (do 15 µm). Tako smo kot prvi opisali strategijo za pripravo umetnih visokomolekularnih struktur v obliki vlaken, ki temeljijo na naravnih spektrinskih gradnikih iz človeškega distrofina in načrtovanih motivih OV. Nadalje smo dokazali, da je povezovanje preko motivov OV mogoče uravnavati s kovinskimi ioni (Zn(II)) in kelatorji (EDTA). Za razvoj uporabnih biomaterialov smo razkrili, da lahko načrtovana spektrinska vlakna služijo kot prostorsko urejeno ogrodje za predstavitev funkcionalnih proteinskih domen ali biološko aktivnih peptidov z natančno nastavljivim razmikom v območju od ~35 do 75 ± 10 nm. Predstavljeni rezultati prikazujejo velik potencial modularnega inženiringa proteinskih gradnikov in načrtovanih motivov OV za razvoj inovativnih biomaterialov v biotehnološke, biomedicinske ali bioinženirske aplikacije.20252025-04-16 15:34:55Doktorsko delo/naloga168552sl