Načrtovanje in nadzor delovanja večdelnih od kalcija odvisnih transkripcijskih dejavnikov z ultrazvokomIvanovski, Filip (Avtor) Benčina, Mojca (Mentor) Kalcijeva signalizacijaultrazvoktranskripcijski dejavnikiumetna celična vezjaNatančen prostorski in časovni nadzor celičnih aktivnosti v globljih plasteh tkiv je eden ključnih izzivov sodobne biomedicine. Sodobni pristopi genske in celične terapije si prizadevajo razviti varne in učinkovite metode za daljinsko in lokalno aktivacijo terapevtskih genov in celic. Zaradi visoke prostorske in časovne ločljivosti ter sposobnosti prodiranja v mehka tkiva je ultrazvok obetavno orodje za tak nadzor. V okviru doktorskega dela smo razvili in ovrednotili ultrazvočno metodo za stimulacijo celic, ki omogoča zanesljiv in ponovljiv vdor Ca2? ter aktivacijo na Ca2? odzivnih transkripcijskih dejavnikov. Pri razvoju metode smo analizirali vpliv ultrazvočnih parametrov na Ca2? signalizacijo in posledično aktivacijo načrtovanih transkripcijskih dejavnikov. S pomočjo transkripcijskih dejavnikov na osnovi proteinov NFAT, z načrtovano DNA-vezavno domeno, smo te dejavnike usmerili na specifične tarčne gene in preprečili neželeno aktivacijo endogenih genov, ki jih uravnava NFAT. Funkcionalnost sistema smo potrdili in vitro ter in vivo, v več modelih mišjega ksenografta. Celice smo transplantirali pod kožo ali v peritonealno votlino miši in z ultrazvočno stimulacijo sprožili izražanje kresničkine luciferaze ali protivnetnega citokina interlevkina-10 (IL-10). Za prikaz terapevtskega potenciala metode smo celice, ki ob ultrazvočni stimulaciji izražajo IL 10, enkapsulirali v biokompatibilne cevke in jih kirurško vstavili v peritonealno votlino miši z akutnim kolitisom. Pristop je učinkovito zmanjšal znake akutnega kolitisa, induciranega z DSS, kar je odražala izboljšana morfologija in histopatologija debelega črevesa. Za povečanje modularnosti transkripcijskih dejavnikov in razširitev nabora sonogenetskih orodij smo razvili tudi deljene na Ca2? odzivne transkripcijske regulatorje (SCaTR). Razvili smo dvo- in trodelne različice, ki so ob ultrazvočni stimulaciji v celicah sprožile izražanje luciferaze ali IL-10. Pri tem smo uporabili naravne in načrtovane DNA-vezavne domene, skrajšane oblike proteinov NFAT kot prevajalce Ca2? signalov, aktivacijsko domeno ter obvite vijačnice za dimerizacijo modulov transkripcijskih dejavnikov. Da bi približali ultrazvočno metodo klinični uporabi, smo ultrazvočne parametre dalje optimizirali in skrajšali čas stimulacije z dveh ur na 30 minut. Z zvišanjem amplitude in trajanja Ca2? signalov smo povečali kumulativno koncentracijo Ca2? v celicah in posledično skrajšali čas potreben za povečano izražanje poročevalskega gena. Doktorsko delo poudarja potencial ultrazvoka kot natančnega orodja za prostorsko in časovno modulacijo gensko spremenjenih celic ter odpira nove možnosti za razvoj varnih in ciljno usmerjenih terapij.20252025-04-05 07:15:09Doktorsko delo/naloga168244sl