Vpliv mutacije v genu c9orf72 na izražanje proteinov pri boleznih amiotrofična lateralna skleroza in frontotemporalna demencaČerček, Urša (Avtor) Rogelj, Boris (Mentor) ALSFTDC9orf72aminoacyl-tRNA sintetazetranslacijacelični stresAmiotrofična lateralna skleroza (ALS) in frontotemporalna demenca (FTD) sta neozdravljivi nevrodegenerativni bolezni. Z njunim razvojem so povezani številni proteini, vključno s proteini Tdp-43, Sod1 in Fus. Najpogostejša mutacija pa je razširitev ponovitve heksanukleotida (G4C2) v genu c9orf72. Patološka razširitev se prepiše v toksično smerno (G4C2)n in protismerno (C4G2)n RNA, ki interagira z RNA vezavnimi proteini. Naša skupina je pokazala, da protismerne (C4G2)n RNA interagirajo z alfa podenoto fenilalanin-tRNA sintetaze (Farsa), ki omogoča polnjenje fenilalaninske tRNA. Namen doktorske naloge je raziskati povezavo med mutacijo C9orf72 in funkcijo aminoacil-tRNA sintetaz ter preučiti njihov vpliv na sintezo proteinov in razvoj ALS ter FTD. Osredotočili smo se na novo odkrito interakcijo med protismernimi (C4G2)n ponovitvami in proteinom Farsa, ki smo jo odkrili v naši raziskovalni skupini in preučili učinek na globalno izražanje proteinov ter aktivacijo stresnega odziva. Razvili smo metodo bližnje ligacije RNA-RNA, ki nam omogoča opazovanje lokalizacije protismernih RNA znotraj celice, vključno s citoplazmo, kar do sedaj večinoma ni bilo mogoče. Pokazali smo, da se protismerne ponovitve razporejajo po celotni celici in so prisotne tudi v citoplazmi. Za preučevanje vpliva na izražanje proteinov in aktivacijo celičnega stresa smo uporabili reakcijo »click«, prenos western, RNA »pull-down«, imunocitokemijo in analizo z masno spektrometrijo. Pri tem smo uporabili različne bolezensko pomembne celične modele, vključno z limfoblastoidnimi celičnimi linijami, pridobljenimi od pacientov z mutacijo C9orf72 in diferencirane motoričnim nevronom podobne celice NSC-34. V sklopu doktorske naloge smo pokazali, da je interakcija med (C4G2)n RNA in proteinom Farsa odvisna od dolžine ponovitev in vpliva na vključevanje fenilalanina, kar povzroča nepravilnosti v translaciji. Pokazali smo, da je izražanje proteinov, bogatih s fenilalaninom, zmanjšano v celičnih linijah, pridobljenih od pacientov z mutacijo v genu c9orf72, in v post mortem možganskem tkivu pacientov s C9orf72 ALS ter FTD. Pokazali smo, da so ponovitve RNA (C4G2) zmožne aktivirati kinazo Gcn2 v HEK293 celicah, vendar ne sprožijo akutnega stresnega odziva v bolezensko relevantnih celičnih modelih. Raziskava ponuja pomembne vpoglede v mehanizme ALS in FTD ter zagotavlja nove terapevtske tarče za bolezni, povezane z mutacijo v genu c9orf72.20252025-03-09 08:15:06Doktorsko delo/naloga167722sl