Metilacijski označevalci za karakterizacijo in določanje izvora adenokarcinomov jeterGovejšek, Tina (Avtor) Hauptman, Nina (Mentor) Zidar, Nina (Komentor) Adenokacinomi jeterhepatocelularni karcinomholangiokarcinomadenokarcinom debelega črevesa in dankeduktalni adenokarcinom trebušne slinavkezasevki v jetrihbioinformacijska analizaMS-HRMdPCRmetilacija DNAizražanje genov.Metilacijski označevalci veljajo za eno izmed obetavnih epigenetskih značilnosti raka za diagnosticiranje in razlikovanje adenokarcinomov jeter, ki sodijo med najpogostejša maligna obolenja na svetu. Namen doktorske naloge je bil prepoznati in eksperimentalno potrditi nove diagnostične metilacijske označevalce, ki razlikujejo med dvema najpogostejšima primarnima karcinomoma jeter, hepatocelularnim karcinomom (HCC) in holangiokarcinom (CCA) ter adenokarcinomoma, ki pogosto zasevata v jetra, adenokarcinomom debelega črevesa in danke (CRC) in duktalnim adenokarcinomom trebušne slinavke (PDAC). Ker je metilacija DNA eden ključnih mehanizmov uravnavanja izražanja genov, smo želeli preučiti vpliv spremenjene metilacije DNA izbranih metilacijskih mest na izražanje pripadajočih genov. Prvi del naloge je zajemal obsežno dvostopenjsko bioinformacijsko analizo, ki je vključevala učno množico podatkov, pridobljenih iz javno dostopne baze TCGA z 2853 vzorci ter neodvisno testno množico podatkov, pridobljenih iz javno dostopne baze GEO s 782 vzorci. Z njo smo uspešno prepoznali nove diagnostične označevalce metilacije DNA, ki so hipermetilirani pri raku ter oblikovali diagnostične panele, ki razlikujejo med izbranimi adenokarcinomi. Paneli so dosegli občutljivost 77,8-95,9 %, specifičnost 91,5-97,7 % ter diagnostično natančnost 85,3-96,4 % za razlikovanje med izbranimi adenokacinomi in pripadajočimi zdravimi tkivi. Metilacijo DNA izbranih metilacijskih mest smo eksperimentalno potrdili z metodama metilacijsko občutljive talilne krivulje visoke ločljivosti (MS-HRM) in digitalnim PCR (dPCR) na 149 vzorcih tkiv, fiksiranih v formalinu in vklopljenih v parafin. Vključili smo vzorce HCC, CCA, CRC, PDAC, vzorce pripadajočih zdravih tkiv, zasevke CRC v jetrih in zasevke PDAC v jetrih. Paneli metilacijskih označevalcev, ki smo jih eksperimentalno potrdili, se nahajajo v promotorjih naslednjih genov in dolgih nekodirajočih RNA (lncRNA): RNF135 (angl. ring finger protein 135), EFNB2 (angl. ephrin-B2), RNF125 (angl. ring finger protein 125), ABLIM1 (angl. actin-binding LIM protein 1), OSMR (angl. oncostatin M receptor), LIFR-AS1 (angl. leukemia inhibitory factor receptor antisense RNA 1) in PROX1-AS1 (angl. prospero homeobox 1 antisense RNA 1). Paneli so razlikovali med HCC, CCA, zasevki CRC v jetrih, zasevki PDAC v jetrih in zdravim tkivom jeter z občutljivostjo 66,7-100 %, s specifičnostjo 94,9-100 % in z diagnostično natančnostjo 93-100 %. Rezultati dPCR so bili dodatno potrjeni z bioinformacijsko analizo z uporabo neodvisnega nabora podatkov 487 vzorcev iz podatkovnih zbirk TCGA in GEO. Rezultati MS-HRM, dPCR in bioinformacijske analize so pokazali visoko skladnost. Prav tako smo dokazali, da se hipermetilacija DNA preiskovanih promotorjev ohranja od primarnih CRC in PDAC do njihovih zasevkov v jetrih. Za izbrane gene smo izvedli metodo kvantitativne verižne reakcije s polimerazo v realnem času (qPCR) in analizo izražanja genov ter izračunali korelacijo med metilacijo DNA in izražanjem genov. Rezultati so pokazali, da lahko spremenjena metilacija preiskovanih promotorjev vpliva na izražanje genov pri preučevanih adenokarcinomih.20252025-02-28 07:15:15Doktorsko delo/naloga167566sl