Inhibicija rekombinantnih NAD(P)H:kinon oksidoreduktaz iz Escherichie coli in Staphylococcus aureus z derivati hidroksinaftojske kislineNemanič, Vivian (Avtor) Novinec, Marko (Mentor) protimikrobno delovanjeNAD(P)H:kinon oksidoreduktazahidroksinaftojska kislinaS. aureusŽe vse od začetka razvoja antibiotikov so opazili pojav odpornosti. Prekomerna in napačna uporaba protimikrobnih sredstev, prekomerno predpisovanje antibiotikov in široka uporaba le-teh v industriji je povzročila nenadzorovano širjenje odpornosti na antibiotike preko mikrobnih populacij. Iskanje novih antibiotikov ter njihovih tarč je ključnega pomena, zato identifikacija proteinskih tarč med drugimi predstavlja enega od načinov za odkrivanje in razvoj novih terapevtikov. V primeru boja proti patogenim organizom bi iskali proteine, ki so ključni za nemoteno delovanje organizma in posledično na ta način ugotovili, kako onemogočiti njihovo delovanje. Za derivate hidroksinaftojske kisline, ki so biološko aktivne male molekule, je bilo predhodno dokazano, da zavirajo rast nekaterih grampozitivnih bakterij, med njimi Staphylococcus aureus, in da se vežejo na WrbA. Cilj te magistrske naloge je bil pripraviti NAD(P)H:kinon oksidoreduktazo iz E. coli, WrbA ter njena homologna proteina iz S. aureus, ffp1 in ffp2, in testirati vpliv nekaterih derivatov hidroksinaftojske kisline na encimsko aktivnost omenjenih proteinov. Vse tri zapise za proteine smo uspešno izrazili in izolirali, jim dodali kofaktor FMN ter preverili njihovo aktivnost s spremljanjem oksidacije substrata NADH v NAD$^+$ preko merjenja absorbance. Uspešno smo testirali vpliv petih različnih derivatov hidroksinaftojske kisline na vse tri encime. Derivata, ki sta najbolj uspešno inhibirala vse tri encime, sta spojina 1 (1-hidroksi-2-naftojska kislina) in spojina 7 (2-hidroksi-1-naftojska kislina). V primerjavi s pozitivno kontrolo je spojina 1 inhibirala aktivnost WrbA za 39 %, ffp1 za 67 % in ffp2 za 82 %, spojina 7 pa je inhibirala WrbA za 49 %, ffp1 za 86 % in ffp2 za 87 %. Encim, ki je bil najbolj dovzeten za inhibicijo z vsemi preizkušenimi spojinami, je ffp2. Nazadnje smo okarakterizirali oba neznana homologa, ffp1 in ffp2, z določitvijo kinetičnih parametrov in napovedali njuno strukturo z orodjem AlphaFold. Izkazalo se je, da imajo vsi trije proteini podobne vrednosti kinetičnih parametrov in njihove strukture podobno zvitje, zato je verjetno, da pripadajo isti družini proteinov. Spojini 1 in 7 bi lahko predstavljali potencial za novo protimikrobno spojino, a bi bilo v prihodnosti potrebno raziskati, zakaj pri celični rasti pride do popolne inhibicije, aktivnost encimov pa je le delno inhibirana, in ali morda obstajajo še katere druge proteinske tarče v S. aureus, ki bi to razložile.20252025-02-19 14:30:02Magistrsko delo/naloga167398sl