Priprava in manipulacija umetnega kromosoma kvasovkeRatajc, Tim (Avtor) Petrovič, Uroš (Mentor) umetni kromosom kvasovkepYAC4Saccharomyces cerevisiaeCRISPR-Cashomologna rekombinacijasestavljanje po GibsonuEGFPEBFPLacZKanMXUmetni kromosomi kvasovke so bili v preteklosti sintetizirani z namenom vstavljanja velikih fragmentov za pripravo genomskih knjižnic. Ključno vlogo so imeli pri projektu Človeški genom, v zadnjih letih pa je zanimanje zanje v znanstveni sferi precej upadlo. Z napredkom molekularno-bioloških tehnik bi lahko bili ponovno zanimivi za uporabo kot platforma za vstavljanje, spreminjanje in izražanje rekombinantnih genetskih elementov v celicah kvasovk S. cerevisiae. V magistrskem delu smo pripravili posodobljen umetni kromosom kvasovke na osnovi vektorja pYAC4, kjer smo zamenjali telomerne regije, da je njegov skelet mogoče pomnožiti tudi z metodo PCR, in selekcijske označevalce za lažjo uporabo v laboratorijskih sevih kvasovke Saccharomyces cerevisiae. V tako pripravljen modificiran umetni kromosom kvasovke smo nato dodajali kasete z reporterskimi geni in primerjali učinkovitost sestavljanja skeleta in kaset med metodo sestavljanja po Gibsonu in metodo sestavljanja s homologno rekombinacijo v celicah kvasovke. Vstavljene kasete smo nato spreminjali in vivo z metodo CRISPR-Cas9 neposredno na umetnem kromosomu. Učinkovitost spreminjanja kaset smo ovrednotili na podlagi izražanja reporterskih genov ter preverjali, kakšen vpliv ima linearizacija umetnega kromosoma na sposobnost rasti transformant ter ali ima shranjevanje z zmrzovanjem negativen vpliv na ohranjanje umetnih kromosomov v kvasovkah. Ugotovili smo, da je sestavljanje s homologno rekombinacijo v kvasovkah S. cerevisiae časovno in delovno bolj obremenjujoče, daje pa boljše rezultate pri zlaganju več in kompleksnejših fragmentov, kot sestavljanje z metodo po Gibsonu. Kasete, vstavljene v umetni kromosom kvasovke, je mogoče spreminjati s sistemom CRISPR-Cas9 neposredno na kromosomu, linearizacija umetnih kromosomov in shranjevanje kvasovk pri -80 °C pa nimata negativnega vpliva na rast kvasovk.20242024-12-12 14:18:29Magistrsko delo/naloga165879sl