Proizvodnja rekombinantnega s cisteinom bogatega sekrecijskega proteina (CRISP) iz modrasovega strupa in primerjava njegovih biokemijskih lastnosti z naravnim proteinomGolič, Vid (Avtor) Leonardi, Adrijana (Mentor) Križaj, Igor (Komentor) Gadov strupVipera ammodytes ammodytesCRISPrekombinantni VaaCRISP-1E. colibakterijski ekspresijski sistemS cisteinom bogati sekrecijski proteini (CRISP) so monomerni proteini z maso 20 do 30 kDa in 10–16 ohranjenimi cisteinskimi ostanki. V tej magistrski nalogi smo želeli pripraviti CRISP-1 iz strupa modrasa (Vipera ammodytes ammodytes) v rekombinantni obliki. Uporabili smo sev »SHuffle K-12« bakterije E. coli z vstavljenim plazmidom pMAL-c5X. VaaCRISP-1 smo izrazili kot fuzijski konstrukt, ki je na svojem N- terminalnem koncu vseboval protein, ki veže maltozo (MBP5), temu je sledilo zaporedje za cepitev z aktiviranim faktorjem X (FXa) in pa zapis za modrasov VaaCRISP-1 (UniProt ID A0A1I9KNM0_VIPAA) brez signalnega zaporedja (rVaaCRISP-1). Po izražanju smo fuzijski protein izolirali s pomočjo afinitetne kromatografije na koloni z amilozno smolo. Cepitev produkta z FXa smo izvedli, ko je bil ta še vezan na koloni ali po eluciji iz nje. Intaktni fuzijski konstrukt je bil stabilen, topen in jasno zaznaven na gelu po gelski elektroforezi. Po cepitvi z FXa pa produkta z maso, ki bi ustrezala rVaaCRISP-1, na gelu ni bilo. Predvidevamo, da zaradi agregacije nepravilno zvitih molekul rVaaCRISP-1 takoj po odstranitvi MBP5. Navkljub temu, da je sev E. coli SHuffle K-12 posebej prilagojen za proizvodnjo proteinov, ki vsebujejo več disulfidnih mostičkov, zvijanje rVaaCRISP-1 ni bilo uspešno. S čiščenjem vzorca na koloni C18 na sistemu HPLC nam je vendarle uspelo izolirati dovolj produkta, da smo z določitvijo njegovega N-terminalnega zaporedja z metodo po Edmanu lahko potrdili, da gre za rVaaCRISP-1. Čeprav smo se trudili optimizirati pogoje izražanja s spreminjanjem koncentracije IPTG, temperature, in časa izražanja, izkoristka nismo uspeli izboljšati nad 10 μg produkta/L kulture. Sklepamo torej, da sev E. coli SHuffle K-12 ni primeren za proizvodnjo rVaaCRISP-1.[V. Golič]20242024-11-30 07:15:43Magistrsko delo/naloga165301sl