Priprava dimernih različic človeškega katepsina B z mestno-specifično saturacijsko mutagenezoDavidovikj, Mladen (Avtor) Novinec, Marko (Mentor) katepsin BdimermutagenezaKatepsin B je cisteinska peptidaza, ki sodi v skupino papainu podobnih peptidaz. Katepsin B je monomeren in globularen encim, ki je prisoten v večini živih organizmov ter sodeluje pri raznih osnovnih fizioloških in patoloških procesih. V tej raziskavi smo poskusili pripraviti dimerno različico katepsina B. Oligomerizacija encimov v določenih primerih lahko povzroči spremembe v njihovih lastnostih, kot so povečana stabilnost ali večja katalitična učinkovitost. Zato smo poskusili ta proces posnemati v laboratorijskih poskusih. Najprej smo izbrali 19 mest v aminokislinski verigi na spodnji površini proteina glede na standardno orientacijo, na katerih smo pripravili knjižnice mutant z metodo mestna-specifična saturacijska mutageneza. Pripravljene knjižnice smo presejali na dimerizacijo z uporabo bakterijskega dvohibridnega sistema na osnovi adenilat ciklaze in tako dobili 15 morebitnih dimerov z mutacijami v šestih različnih mestih v aminokislinski verigi. Poskusili smo izraziti in izolirati štiri morebitne dimere, kar nam je uspelo le v enem primeru. Analizirali smo dimer, sestavljen iz variant catB_SNS154,156WNH in catB_SNS154,156GNP, s kromatografijo na osnovi ločevanja po velikosti. Ugotovili smo, da pri pogojih, pri katerih smo izvajali poskus, ni prišlo do dimerizacije. Različici smo aktivirali avtokatalitično. Encimsko aktivnost izoliranim različicam smo potrdili s kinetično metodo in določili njihovi konstanti K$_m$, ki sta imeli vrednosti 34±6 µM in 142±54 µM.20242024-10-24 12:30:01Magistrsko delo/naloga164410sl