Spremljanje fenotipskih sprememb fibroblastov z optično mikroskopijoZupančič, Matic (Avtor) Urbančič, Iztok (Mentor) Koklič, Tilen (Komentor) fibroblastmiofibroblastfibrozananodelcikonfokalna fluorescenčna mikroskopijaFibroza je zapletena kronična bolezen, do katere lahko pride v številnih tkivih po njihovi poškodbi. Ključen uvodni dogodek v celjenju poškodb ali nastanku fibroze je aktivacija fibroblastov in njihova posledična diferenciacija do svoje funkcionalne oblike, miofibroblasta. Fibroza je tudi pogosta posledica izpostavljenosti nanodelcem v onesnaženem zraku. Nanodelcev po inhalaciji zdrava pljuča niso zmožna odstraniti, kar privede do kopičenja v alveolih. Ta lastnost, v kombinaciji s svojo veliko površino in visoko reaktivnostjo le-te, privede do kroničnega vnetja pljuč in aktivacije fibroblastov v njih že po enkratni izpostavitvi nanodelcem. Ti so močno heterogeni, tako v reaktivnosti njihove površine kot v velikosti in obliki, zaradi česar je potrebno v namen zagotavljanja varnosti opredeliti sposobnost proženja vnetja oziroma fibroze za posamezne nanodelce. S tem namenom smo razvili metodo z uporabo konfokalne mikroskopije, ki nam omogoča spremljanje fenotipskih sprememb živih fibroblastov in s tem zaznavo diferenciacije do miofibroblastov kot rezultat izpostavitve različnim dejavnikom. Uporabili smo celično linijo MLg kot in vitro model pljučnih fibroblastov, v katerih smo fluorescenčno označili jedro, membrane in aktin. Kot pozitivno kontrolo za aktivacijo fibroblastov smo izbrali tkivni rastni faktor beta (TGF-β1). Po določitvi ustreznih koncentracij vseh fluorescenčnih sond smo določili minimalni čas po izpostavitvi TGF-β1, pri katerem je prišlo do statistično signifikantne razlike med negativno in pozitivno kontrolo ter ustrezno podlago stekla, prevlečenega s kolagenom I, na katero smo nacepljali celice MLg. Spremljali smo številne fenotipske značilnosti celic, predvsem razlike v njih med negativno in pozitivno kontrolo, naredili izbor največkrat opaženih spremenljivk: prisotnost stresnih vlaken, vidni fokalni adhezijski kompleksi (FAK), površina celice, dvojedrnost, “izrastki” (lamele), prisotnost tankih izrastkov oziroma nitk. Izmed vseh v naboru sta se izkazali za najbolj občutljivi spremenljivki prisotnost FAK in površina celice oziroma povečanje le-te. V namen čim lažje avtomatizacije metode smo se odločili, da spremljamo le razlike v površini celice. S spremljanjem površine celice smo po dodatku TGF-β1 opazili pojav druge populacije celic z večjo površino, s čimer smo ovrednotili TGF-β1 kot primeren dodatek za pozitivno kontrolo. Nato smo izvedli triplikat bioloških ponovitev eksperimenta z negativno in pozitivno kontrolo ter nanomateriali MWCNT401, TiO2NT in »Diesel«. Dobljeni rezultati nakazujejo, da izpostavitev fibroblastov nanodelcem in vitro ni dovolj za njihovo diferenciacijo v miofibroblaste. Postavljeno metodo spremljanja fenotipskih sprememb kot posledica izpostavitvi nanodelcem bi lahko z vključitvijo predlaganih izboljšav razvili do validirane metode za napoved nastanka fibroze oziroma opredelitve toksičnosti različnih nanodelcev v pljučih. Predlagana metoda bi omogočala hitrejše in cenejše napovedovanje vpliva nanodelcev na razvoj fibroze pljuč ter hkrati zmanjšala potrebo po testnih živalih v te namene.20242024-10-19 08:45:04Magistrsko delo/naloga164291sl