Nekroptozna aktivnost N-končne domene MLKL v celicah HEK in njeno izražanje v E. coliKozole, Evgen (Avtor) Gunčar, Gregor (Mentor) MLKLMLKL123nekroptozaHEK-FlpIn-293 celiceCelična smrt je ključni biološki proces za vzdrževanje homeostaze in obrambo organizma pred okuženimi, mutiranimi ali poškodovanimi celicami. V omenjenih primerih lahko celica sproži signalni odziv, ki pripelje do apoptoze, kontrolirane celične smrti ali do nekroze, nekontrolirane celične smrti. V zadnjem desetletju je veliko pozornosti pritegnila nekroptoza, za katero velja, da je do neke mere kontroliran proces, kateremu sledijo patološka stanja, ki niso kontrolirana, kot je na primer vnetje. Glavni posrednik signalnega odziva pri nekroptozi je MLKL (angl. mixed-lineage kinase domain-like), ki je sestavljen iz psevdokinazne domene in domene svežnja štirih vijačnic (4HB). Študije so pokazale, da je 4HB domena odgovorna za oligomerizacijo in translokacijo MLKL na celično membrano, kjer povzroči njeno permeabilizacijo. V magistrskem delu smo želeli preveriti ali skrajšan del MLKL, ki obsega 123 aminokislinskih ostankov in predstavlja 4HB domeno, povroči celično smrt. MLKL123 smo uspešno izrazili v bakterijskem ekspresijskem sevu E. coli BL21 pLysS in ga tudi izolirali z afinitetno kromatografijo, vendar so se tekom izolacije pojavile težave, saj so se poleg lis, ki so predstavljale naš protein, pojavljale tudi nekatere ostale nespecifične lise (potencialni razgradni produkti pri izražanju). Prav tako smo v sesalski celični liniji HEK FlpIn-293 uspešno pripravili dve stabilni liniji, ena je vsebovala samo MLKL123, druga pa je poleg proteina vsebovala še fuzijski protein EGFP, ki je služil za lažje opazovanje s fluorescenčnim konfokalnim mikroskopom. V obeh primerih smo ugotovili, da se je protein pretežno nahajal v predelu celične membrane, vendar je test MTT pokazal, da nobeden od konstruktov ne izkazuje citotoksičnosti, kljub okrogli morfologiji celic.20242024-10-14 14:55:02Magistrsko delo/naloga163951sl