Transport retrotranspozonov LINE1 v jedro s karioferiniNograšek, Tim (Avtor) Župunski, Vera (Mentor) retrotranspozon LINE1ORF1pkarioferin αtest jedrnega uvozakoimunoprecipitacijaRetrotranspozoni LINE1 (ang. long interspersed nuclear element) so avtonomni mobilni DNA elementi, ki predstavljajo 17 % človeškega genoma in so edina aktivna različica transpozicijskih elementov pri človeku. Gen LINE1 vsebuje zapis za tri proteine: ORF0p, ORF1p in ORF2p. Slednja sta glavna gradnika pri sestavi ribonukleoproteinskega kompleksa, povezuje pa ju lastna mRNA. Kompleks je pomemben za aktivno retrotranspozicijo in vnos lastne DNA na novo mesto v genomu. Prenos kompleksa v jedro ni povsem znan, potrjeno pa ta potuje med celično delitvijo, ko se zmanjša integriteta jedrni ovojnici. Prisotnost retrotranspozona LINE1 je bila potrjena tudi pri somatskih nevronskih celicah, kar pomeni, da se lahko prenese tudi preko jedrne ovojnice. En izmed potencialnih načinov je z jedrnimi importini, imenovani tudi karioferini. Transportni kompleks je sestavljen iz tovora, karioferina α, ki prepozna tovor, in karioferina β1, ki je odgovoren za vezavo na karioferin α in prenos skozi jedrno poro. V prvem delu magistrske naloge smo izolirali proteine, ki so potrebni za izvedbo testa jedrnega uvoza. Izolirali smo proteine ORF1p, vseh sedem karioferinov α in karioferin β1, povezane s fuzijskim proteinom GST. Vsi proteini so se nahajali v topni obliki in smo jih uspešno očistili. V drugem delu smo želeli preveriti, če obstajajo interakcije med ORF1p in karioferini α. V ta namen smo s koimunoprecipitacijo preverili, če se prekomerno izražen ORF1p-FLAG poveže z endogenimi karioferini α. Z rezultati nismo potrdili medsebojnega interagiranja med ORF1p in karioferini α. V tretjem delu smo testirali posamezne karioferine α kot potencialne prenašalce ORF1p v jedro. Pri testu jedrnega uvoza (NIA) smo sesalskim celicam HeLa odstranili citoplazmo in dodali samo ORF1p ter izbran karioferin α in β1. S protitelesi smo lokalizirali posamezne proteine in pokazali, da sta karioferina α3 in α4 jedrna prenašalca ORF1p. Pri testu NIA se je ORF1p pred dodatkom prenašalcev nahajal izven jedra, z dodatkom karioferinov α3 in α4 pa večinoma v jedru. Pomemben dejavnik pri testu je bil tudi dodatek energije v obliki ATP, ki je bil ključen za uspešen prenos. Z inhibitorjem jedrnih por WGA smo dokazali, da je prenos ORF1p možen skozi jedrne pore tudi pri nedelečih se celicah. V prihodnjih raziskavah bi bilo potrebno preveriti interakcije med izoliranimi proteini in optimizirati test jedrnega uvoza.20242024-09-27 13:05:03Magistrsko delo/naloga162816sl