Ravni izražanja in aktivnosti katepsina X in izooblik enolaze v fenotipsko različnih populacijah celic SH-SY5YHorvat, Anja (Avtor) Pišlar, Anja (Mentor) Horvat, Selena (Komentor) celice SH-SY5Ydiferenciacijaenolazanevrotrofična aktivnostkatepsin XOsnovna gradbena enota centralnega živčnega sistema je nevron. Za preučevanje procesov v nevronih se uporabljajo številni in vitro celični modeli in med njimi tudi diferencirane celice SH-SY5Y. Pomembno vlogo pri diferenciaciji nevronov imajo nevrotrofični dejavniki, katerim podobno delovanje izkazuje tudi glikolitični encim γ-enolaza. Nevrotrofično aktivnost γ-enolaze uravnava cisteinska peptidaza katepsin X s proteolitično cepitvijo zadnjih dveh aminokislin na C-koncu γ-enolaze. V sklopu magistrske naloge smo določili ravni izražanja in aktivnosti katepsina X ter izooblik enolaze v fenotipsko različnih populacijah celic SH-SY5Y, katere sestavljajo trije različni fenotipi, in sicer epiteljiski S-tip, nevronski N-tip in vmesni I-tip celic SH-SY5Y. Najprej smo vzpostavili protokol za diferenciacijo in uspešno obogatitev posameznih populacij celic SH-SY5Y, pri čemer smo spreminjali podlago, sestavo gojišča in čas gojenja celic, kar smo spremljali s pomočjo svetlobnega invertnega mikroskopa. 10-dnevno gojenje celic v gojišču z zmanjšano vsebnostjo seruma ob dodani 5 µM retinojski kislini se je izkazalo za uspešno za pridobitev obogatenih populacij celic tipa S in N. Z vrednotenjema izražanja označevalcev s pomočjo prenosa western in konfokalne mikroskopije smo opazili, da je izražanje označevalca epitelijskih celic vimentina povišano v populaciji celic tipa S ter izražanje označevalcev nevronov, in sicer tirozin hidroksilaze in z rastjo povezan protein 43, povišano v populaciji celic tipa N. Na obogatenih populacijah S- in N-tipa smo preučili raven izražanja katepsina X in njegovo aktivnost kot tudi raven izražanje tarče katepsina X v nevronskih celicah, enolaze. Pokazali smo, da je največje izražanje proteina katepsina X v celicah tipa N, medtem ko je bila največja aktivnost katepsina X v celicah tipa S. Izražanje izooblike α-enolaze je neodvisno od posamezne populacije celic SH-SY5Y, medtem ko je višja raven izooblike γ-enolaze značilna za N-tip celic SH-SY5Y, kar smo vrednotili s prenosom western in encimsko-imunskim testom. Izražanje aktivne oblike γ-enolaze je bilo povišano v obeh populacijah celic SH-SY5Y napram kontrolnim celicam, vendar je bilo povišanje izrazitejše v N-tipu celic SH-SY5Y. S pomočjo konfokalne mikroskopije smo pokazali močnejšo ko-lokalizacijo γ-enolaze in katepsina X v celicah N-tipa, predvsem v izrastkih celic, t.i. nevritih, kar nakazuje na vlogo, ki jo ima γ-enolaza v procesu rasti in diferenciacije nevronov ter njeno uravnavanje s katepsinom X.20242024-09-13 08:45:03Magistrsko delo/naloga161711sl