Karakterizacija protibakterijskega delovanja izbranih derivatov pirazola na molekulski ravniMlinar, Karmen (Avtor) Novinec, Marko (Mentor) odpornost na antibiotikederivati pirazolaprotimikrobno delovanjeL-treonin dehidrogenazakooperativnostOdpornost mikroorganizmov na antibiotike v današnjem svetu predstavlja eno največjih groženj javnemu zdravju. Številne raziskovalne skupine zato med svoje prioritetne naloge uvrščajo iskanje novih antibiotikov in njihov tarč. Pirazol in njegovi derivati imajo dokazano protimikrobno delovanje. Derivat 4-(2-aminoetil)-1-(piridin-2-il)-1H-pirazol-5-ol zavira rast bakterije Escherichia coli, tako da se veže na protein L-treonin dehidrogenazo (TDH) in zavira njeno aktivnost. Slednja sodeluje pri medcelični komunikaciji in metabolizmu aminokislin. Ima ključno vlogo pri razgradnji L-treonina v glicin, hkrati pa pri človeku ni znanih homologov, zato je dober kandidat za novo tarčo antibiotikov. Cilj magistrske naloge je bil preveriti inhibitorno delovanje izbranih derivatov pirazola na TDH iz E. coli ter z antibiogrami preveriti njihovo zaviranje rasti štirih bakterijskih vrst: Escherichia coli, Bacillus thuringiensis, Pseudomonas aeruginosa in Staphylococcus aureus. Ker je znano, da kelatorji lahko vežejo Zn2+ ione iz strukture TDH in tako zavirajo njeno aktivnost, smo z merjenjem absorpcijskih spektrov izbranih derivatov pirazola preverili tudi njihovo sposobnost kelacije Zn2+. TDH potrebuje kofaktor NAD+, ki se tekom katalizirane reakcije pretvori v NADH, kar je mogoče spremljati fluorimetrično. Pripravili smo rekombinantno TDH in analizirali njeno aktivnost v prisotnosti dvanajstih derivatov pirazola. Ugotovili smo, da jih 10 deluje kot linearni ali hiperbolični inhibitor. Med linearnimi ima najvišjo afiniteto derivat I2, zato smo analizirali njegov mehanizem delovanja in zaključili, da gre za kompetitivni inhibitor. Z antibiogrami smo ugotovili, da vsi testirani derivati pirazola, razen derivata IC, zavirajo rast vsaj enega testiranega seva. Vendar pa derivati, ki najbolje inhibirajo rast bakterije E. coli, delujejo kot šibki inhibitorji testirane tarče TDH, zato verjetno delujejo tudi na druge bakterijske tarče. Merjenje absorpcijskih spektrov je pokazalo, da večina derivatov kelira cinkove ione in zato niso primerni kandidati za antibiotike. Čeprav derivat I2 ne kelira cinkovih ionov in deluje kot relativno dober inhibitor TDH, njegovo delovanje in vivo ni dovolj učinkovito za uporabo kot antibiotik. Med testiranimi derivati pirazola nismo našli spojine s potencialom za nov antibiotik, zato je v prihodnosti raziskovanje potrebno razširiti na večje število derivatov, hkrati pa se osredotočiti tudi na iskanje drugih tarč. Kljub temu, pa smo tekom raziskovanja podrobneje okarakterizirali samo delovanje encima TDH in prišli do dveh pomembnih ugotovitev: (I) pri vezavi Thr pride do homotropičnega efekta kooperativnosti, (II) cinkovi ioni delujejo regulatorno na TDH, saj zavirajo njeno delovanje z vrednostjo EC50 okoli 55 µM.20242024-09-12 14:30:01Magistrsko delo/naloga161618sl