Vloga receptorja ACE2 in proteaze TMPRSS2 pri tvorbi sincicijev v celicah, ki izražajo različice proteina S SARS-CoV-2Musina, Valeriya (Avtor) Manček Keber, Mateja (Mentor) Župunski, Vera (Komentor) protein SSARS-CoV-2tvorba sincicijevACE2TMPRSS2Glikoprotein S na površini virusa SARS-CoV-2 je ključni dejavnik pri okužbi. Poleg pritrditve in vstopa virusa v tarčne celice, omogoča protein S tudi tvorbo sincicijev. Sinciciji so večje večjedrne celice, ki nastanejo zaradi fuzije okuženih celic s sosednjimi neokuženimi celicami. Njihov nastanek poveča širjenje virusa in kompleksnost bolezni COVID-19. Fuzija celic je odvisna predvsem od fuzijskega potenciala proteina S na površini okuženih celic. Poleg tega je za tvorbo sincicijev potreben enak receptor kot za vstop virusa, ACE2. Prisotnost proteaze TMPRSS2 na površini tarčnih celic pa dodatno pospešuje fuzijo celic, saj omogoča proteolitsko cepitev proteina S. Podobno drugim RNA-virusom se tudi SARS-CoV-2 hitro spreminja, zato so od njegovega pojava divji tip nadomestile različice, ki vsebujejo številne mutacije, zlasti v proteinu S. Mutacije proteina S vplivajo na prenosljivost virusa, njegovo patogenost in zmožnost tvorbe sincicijev. V magistrskem delu smo preučili sposobnost celic, ki izražajo različice proteina S SARS-CoV-2, da tvorijo sincicije. Analizirali smo različico proteina S, ki se je pojavila v Wuhanu, ter naravni različici delta in XBB.1.5. Poleg tega smo uvedli točkovne mutacije N501Y v receptor vezavno domeno, P681H v FCS in T716I v podenoto S2 proteina S. V okviru magistrskega dela smo tvorbo sincicijev preučili na dva načina. S fuzijskim testom s cepljeno luciferazo smo primerjali fuzijski potencial različic proteina S ter preučili vpliv prisotnosti receptorja ACE2 in proteaze TMPRSS2 na tvorbo sincicijev. Vse izbrane naravne različice proteina S SARS-CoV-2 so pokazale primerljivo stopnjo nastanka sincicijev. Mutaciji N501Y in P681H sta fuzijo celic zvišali, T716I pa jo je znižala. Poleg tega so sinciciji nastajali tudi v odsotnosti receptorja ACE2, če je bila na površini akceptorskih celic prisotna proteaza TMPRSS2. V drugem delu magistrske naloge smo preučevali še kinetiko nastanka sincicijev. V ta namen smo v komercialno dostopni vektor Simplicon vstavili zapise za izbrane različice proteina S in izvedli in vitro transkripcijo. Nato smo potrdili izražanje vseh rekombinantnih proteinov v transficiranih celicah ter prisotnost vseh različic proteina S razen delte na površini transficiranih celic. Kinetiko nastanka sincicijev smo spremljali z avtomatskim mikroskopom, vendar poskusi niso bili uspešni in nismo dobili ponovljivih rezultatov. Postopek bi bilo zato potrebno izboljšati že na nivoju transfekcije z uporabo druge celične linije, drugega načina vnosa replikonov RNA ali z dodatkom proteina virusa Vaccinia B18R. Poleg tega bi bila potrebna optimizacija analize rezultatov in preizkus uporabe drugih programov. Rezultati magistrske naloge potrjujejo, da imajo različice proteina S SARS-CoV-2 različne fuzijske potenciale, in prispevajo k boljšemu razumevanju vpliva drugih dejavnikov, kot sta ACE2 in TMPRSS2, na fuzijo celic.20242024-09-12 13:35:00Magistrsko delo/naloga161602sl