Priprava in karakterizacija proteinskih adapterjev AAA+ ATPaze p97, Npl4 in Ufd1Andoljšek, Maša (Avtor) Podobnik, Marjetka (Mentor) Pavšič, Miha (Komentor) AAA+ ATPaza p97adaptorski proteinUfd1Npl4popravljanje DNApriprava rekombinantnih proteinovkarakterizacija proteinovmolekulske interakcijePoškodbe genomske DNA povzročajo endogeni ali eksogeni dejavniki, kot so reaktivni metaboliti, ultravijolično in ionizirajoče sevanje, kemikalije itd. Nepopravljene poškodbe lahko vodijo do nestabilnega genoma in bolezni, kot so rak, pospešeno staranje ali nevrodegenerativne bolezni. Med poškodbe DNA sodijo tudi kovalentne povezave proteinov z DNA (ang. DNA-protein crosslinks, DPC). Pri človeku odpravljanje DPCjev vključuje proteazo SPRTN, ki razgradi kovalentno vezane proteine do peptidov, nato pa ostali mehanizmi opravijo preostali del popravljanja. V tem procesu s SPRTN sodelujejo tudi proteini p97, Ufd1 in Npl4. p97 ali tudi VCP (ang. valosin-containing protein) je AAA+ ATPaza, ki iz makromolekulskih kompleksov ekstrahira polipeptidne substrate in jih translocira skozi poro v sredini p97 heksamera, kar energijsko poganja hidroliza ATP. Raznolikost delovanja p97 omogočajo partnerski oziroma adapterski proteini; znanih je že več kot 30. Adapterja Npl4 in Ufd1 delujeta v paru in s p97 sodelujeta pri različnih bioloških procesih, kot so kontrola delovanja kromosomov, razgradnji nepravilno zvitih proteinov ter regulaciji kromatina, p97-Npl4/Ufd1 pa skupaj SPRTN sodelujejo tudi pri odpravljanju DPCjev. Razumevanje interakcij p97 z adapterji je ključnega pomena za razumevanje mehanizma delovanja teh molekul in potencialne terapevtske uporabe. Namen magistrske naloge je bila priprava rekombinantnih proteinov Npl4 in Ufd1, njuna karakterizacija ter osnovna analiza interakcij med njima in p97. Delo je vključevalo molekulsko kloniranje, izražanje rekombinantnih proteinov v bakterijskih celicah, izolacijo in čiščenje proteinov s kromatografskimi metodami, biokemijsko in biofizikalno analizo čistosti, stabilnosti ter pravilnega zvitja proteinov, ter preliminarno karakterizacijo proteinskih interakcij. Npl4 in Ufd1 smo uspešno klonirali in izrazili v bakterijskih celicah. Optimizacija pogojev je omogočila, da smo oba proteina pridobili v velikih količinah v topni obliki in z visoko stopnjo čistosti. S preliminarnimi poskusi smo pokazali interakcijo med Npl4 in Ufd1 ter njuno posamično interakcijo s p97. Ugotovili smo tudi, da je Ufd1 bolj termično stabilen v primerjavi z Npl4. Rezultati te naloge bodo pomembna podlaga nadaljnjim raziskavam mehanizma delovanja p97 pri DPCjih skupaj z Npl4, Ufd1 in SPRTN.20242024-09-11 15:10:00Magistrsko delo/naloga161495sl