Optimizacija nivojev izražanja peptida SpyTag na nitastem bakteriofagnem vektorju tipa 88Papa, Sara (Avtor) Bratkovič, Tomaž (Mentor) nitasti bakteriofagpredstavitev na bakteriofagusignalni peptidiSpyTagvektor tipa 88Uporaba nitastih bakteriofagov za razvoj rekombinantnih modularnih cepiv velja za obetavno platformo zaradi njihovih ugodnih lastnosti, kot so enostavno genetsko spreminjanje, visoka specifičnost (s tem povezana tudi varnost), imunogenost in visoka stabilnost. Do sedaj so z raziskavami in vitro in vivo uspeli dokazati proti-rakave, proti-virusne, proti-parazitne in proti-bakterijske učinke bakteriofagnih cepiv s predstavljenimi antigenskimi peptidi. Vendar pa kot pomanjkljivost navajajo težave pri pravilnem zvijanju proteinskih antigenov v fuziji s strukturnimi bakteriofagnimi proteini, neučinkovitem prenosu v periplazmo in steričnem oviranju sestavljanja bakteriofagne kapside, kar pa vodi v nezadosten nivo predstavitve antigena na kapsidi. Alternativno bi lahko na bakteriofagu predstavili razmeroma kratke peptide iz t.i. razcepljenih proteinov in te uporabili za vezavo proteinskih antigenov. Primer razcepljenega proteina je sistem SpyTag:SpyCatcher, v katerem se peptidna in proteinska komponenta po specifični vezavi spontano povežeta s kovalentno (izopeptidno) vezjo. V okviru magistrske naloge smo pripravili štiri genske konstrukte za fuzijski protein SpyTag-kapsidni protein pVIII, ki smo jih vstavili v vektor f88KE (bakteriofagni vektor tipa 88, ki nosi dve kopiji gena za glavni kapsidni protein pVIII – divjega tipa in rekombinantno). Konstrukti so se razlikovali v kombinaciji signalnega peptida (bodisi za kotranslacijski ali za posttranslacijski transport v periplazmo bakterije Escherichia coli) in različici peptida SpyTag (SpyTag002_T112H ali SpyTag003) z nekoliko drugačnimi fizikalno-kemijskimi značilnostmi. V petem genskem konstruktu smo v kopijo gena divjega tipa za protein pVIII vnesli redke kodone za levcin s predpostavko, da bodo ti znižali izražanje pVIII divjega tipa in se bo posledično v kapsido vgradilo več kopij rekombinantnega fuzijskega proteina pVIII (v enem od pripravljenih bakteriofagnih vektorjev smo združili takšna genska konstrukta). S testoma ELISA in prenosom western smo primerjalno ovrednotili nivoje izražanja predstavljenih peptidov na bakteriofagih. Ugotovili smo, da redki kodoni za levcin nimajo bistvenega vpliva na znižanje izražanja pVIII divjega tipa oz. da kombinacija genskih konstruktov ne izboljša predstavitve rekombinantnega proteina SpyTag-pVIII na kapsidi nitastega bakteriofaga. Smo pa zaznali občutne razlike v nivojih predstavitve peptidov SpyTag v odvisnosti od uporabljenega signalnega peptida in pozitivnega naboja različice SpyTag: najboljša je bila kombinacija signalnega peptida za kotranslacijski prenos v periplazmo in peptida SpyTag002_T112H z nekoliko nižjim pozitivnim nabojem.20242024-09-11 07:46:31Magistrsko delo/naloga161399sl