Izražanje in izolacija fuzijskega proteina SpyCatcher003-mi3 ter vrednotenje njegovega sestavljanja v nanokletkoLipužič, Marjeta (Avtor) Bratkovič, Tomaž (Mentor) virusu podobni delcisistem SpyCatcher: SpyTagrekombinantni proteininanokletkacepivaNanomateriali so že dolgo predmet raziskovanja kot učinkoviti sistemi za dostavo tarčnih molekul v celice. Sintetični nanonosilci imajo številne omejitve pri načrtovanju in izdelavi, zato so naravni nanonosilci, kot so virusu podobni delci, boljša alternativa. Virusu podobni delci so nano velikosti in posnemajo zgradbo virusnih delcev brez virusnega genoma. Kot takšni so zanimivi zlasti kot platforma za razvoj cepiv. Sistem razcepljenega proteina SpyCatcher:SpyTag izvira iz domene CnaB2 adhezijskega proteina za fibronektin FbaB iz Streptococcus pyogenes in omogoča enostavno konjugacijo proteinov, tudi virusu podobnih delcev. SpyCatcher je sestavljen iz 138 aminokislinskih ostankov in spontano tvori izopeptidno vez s peptidom SpyTag, ki ga sestavlja 13 aminokislinskih ostankov ter skupaj tvorita kovalentno vezan kompleks. Znanstveniki so razvili drugo generacijo sistema (SpyCatcher002:SpyTag002) na podlagi tehnike predstavitve na bakteriofagu in z racionalnim načrtovanjem na podlagi kristalne strukture tretjo (SpyCatcher003:SpyTag003), ki imata izboljšano kinetiko interakcij in sta bolj odporni na temperaturne spremembe. V okviru magistrske naloge smo v bakteriji Escherichia coli izrazili fuzijski protein SpyCatcher003-mi3, ki tvori stabilno nanokletko, SpyTag003 pa smo združili z monomernim rdečim fluorescenčnim proteinom (mRFP). Rekombinantni protein SpyTag003-mRFP smo za nadaljnjo analizo izolirali s kovinsko-kelatno afinitetno kromatografijo, SpyCatcher003-mi3 pa smo iz bakterijskega lizata oborili in nato prečistili z velikostno izključitveno kromatografijo. S poliakrilamidno gelsko elektroforezo v prisotnosti natrijevega dodecil sulfata smo določili čistost in homogenost, z Bradfordovo metodo pa koncentracijo izraženih proteinov. Pridobili smo zelo čista SpyCatcher003-mi3 in SpyTag003- mRFP, ki smo ju z reakcijo konjugacije v razmerju 1:1,5 v prid SpyTag003-mRFP združili. Uspešnost konjugacije smo primerjali z zmesjo SpyCatcher003-mi3 in AP4-mRFP, ki ne tvorita konjugata. Z metodo dinamičnega sipanja svetlobe smo dokazali, da je bila konjugacija proteinov uspešna in smo dobili monodisperzne in homogene konjugirane nanodelce mi3- SpyCatcher003:SpyTag003-mRFP. S poskusom z imortaliziranimi mišjimi makrofagi pa smo ocenili uspešnost fagocitoze nanodelcev. Na podlagi rezultatov lahko trdimo, da je sistem SpyCatcher:SpyTag enostavna in učinkovita platforma za izdelavo novih cepiv na osnovi nanodelcev. Razvoj in uporaba virusu podobnih delcev, združenih z rekombinantnimi antigeni, bi lahko prispevala k reševanju velikih izzivov, kot so hitro razvijajoči se patogeni ali izbruhi zoonoz.20242024-09-11 07:45:05Magistrsko delo/naloga161390sl