Uvedba in optimizacija testov biološke aktivnosti nekaterih spojin, zanimivih za kozmetične preparateTrošt, Pia (Avtor) Dolinar, Marko (Mentor) encimski testtirozinazahialuronidazamatriksna metalopeptidaza-1 (MMP-1)spektrofotometrijaPomembno vlogo pri staranju kože imajo encimi, ki sodelujejo pri sintezi melanina, ali razgrajujejo komponente zunajceličnega matriksa. Mnogi izmed teh encimov so prisotni v vrhnjih plasteh kože, kjer lahko nanje vplivamo z nanosom kozmetičnih izdelkov z aktivnimi sestavinami. V mnoge kozmetične izdelke kot učinkovine dodajajo inhibitorje encimov, ki vplivajo na stanje in izgled kože. Za odkrivanje potencialnih novih inhibitorjev je ključnega pomena razvoj enostavnih in robustnih testov za določanje encimske aktivnosti. V raziskovalni nalogi smo optimizirali test aktivnosti za dva encima, ki sodelujeta pri staranju kože, in sicer tirozinazo ter hialuronidazo. Optimizacija testa za matriksno metalopeptidazo-1 (MMP-1) ni bila uspešna. V vseh primerih smo si kot osnovo izbrali spektrofotometrični test, saj ima preprost postopek izvedbe in omogoča enostavno detekcijo signala tudi pri velikem številu vzorcev. Najprej smo izmerili aktivnost posameznih encimov brez prisotnosti inhibitorja, s čimer smo določili koncentracijo encima, ki daje signal ustrezne intenzitete. Te teste smo nato ponovili v prisotnosti že znanega inhibitorja encima in tako potrdili njegovo učinkovitost. Pri testu aktivnosti tirozinaze smo testirali različne koncentracije encima, barvila tetrametilbenzidin (TMB) in Ag$^+$ ionov. Na podlagi meritev smo pripravili optimiziran postopek, ki smo ga validirali še z meritvami inhibitornega učinka kodžijske kisline (angl. kojic acid), ki je znan inhibitor tirozinaze. Pri testu aktivnosti hialuronidaze smo testirali različne čase inkubacije in koncentracije karbocianinskega barvila »Stains-all« ter hialuronske kisline, ki v reakciji deluje kot substrat. Validacijo optimiziranega postopka smo izvedli z meritvami inhibitornega učinka apigenina, ki inhibira širok nabor hialuronidaz. Z uporabo teh testov je mogoče določiti aktivnost novih inhibitorjev in primerjati njihovo učinkovitost z že znanimi inhibitorji teh encimov. Pri testu aktivnosti MMP-1 smo kot substrat uporabili fluorescenčno označeno želatino, vendar pri merjenju nismo zaznali pričakovanega naraščanja fluorescence. Za optimizacijo tega testa bi verjetno morali uporabiti še kakšen drug substrat in izvesti dodatne teste.20242024-09-06 14:40:01Diplomsko delo/naloga161076sl