Elektrofiziološke in optofiziološke meritve sekrecijske aktivnosti posameznega mešička in vloga amizina: v zdravju in nevrodegeneracijiBunc, Zara (Avtor) Zorec, Robert (Mentor) eksocitoza in endocitozaastrocitiamizinmolekulsko kloniranjeelektrofiziologijaoptofiziologijanevrodegenerativne bolezniEkso- in endocitoza sta ključna mehanizma, ki omogočata homeostazo evkariontskih celic. V primeru nevrodegenerativnih bolezni sta pogosto spremenjena v možganskih celicah in ju zato preučujemo. Protein amizin oz. sintaksin vezavni protein 6 (STXBP6) je protein, ki se nahaja tudi v astrocitih. Deloval naj bi kot endogeni inhibitor eksocitoze, s čimer naj bi omejeval razvoj reaktivnih astrocitov, nevrodegeneracije in nevrovnetnega stanja, kjer sodelujejo lizosomi. Fuzijo slednjih pa inhibira noradrenalin, ki se izloča iz nevronov jedra locus coeruleus. Noradrenalin naj bi prek adrenergičnih receptorjev vplival na delovanje amizina, kar smo preučevali v tej diplomski nalogi. Sestavljena je iz molekulskega kloniranja, elektrofiziologije in optofiziologije. V okviru molekulskega kloniranja smo pripravili rekombinantne konstrukte tako, da smo vektorjema pEGFP-N1_ANP-emd in PL339-pCMV_amizin-PH-EGFP izrezali zapis za zeleni fluorescenčni protein in ga zamenjali za rdečega. Tako smo pridobili vektorja pEGFP-N1_ANP-mCherry in PL339-pCMV_amizin-PH-mCherry. Te vektorje smo v nadaljevanju uporabili za (ko)transfekcijo mišjih astrocitov, kjer smo ugotavljali lokalizacijo proteina amizina in proteina ANP, ki predstavlja marker za sekrecijske mešičke. V okviru elektrofiziologije smo analizirali vpliv amizina na ekso- in endocitozo, kjer smo merili fuzijo in fisijo mešičkov prek spremljanja membranske kapacitivnosti. V primeru transfekcije celic z amizinom divjega tipa, ki se v deležu lokalizira na membrani, smo zaznali zmanjšano frekvenco eksocitotskih sekrecijskih dogodkov. Tega pa nismo zaznali v primeru transfekcije celic z mutiranim amizinom, kateremu je zaradi mutacij v aminokislinskem zaporedju lokalizacija na membrani onemogočena. V okviru optofizioloških meritev smo s pomočjo konfokalnega fluorescentnega mikroskopa pokazali lokalizacijo proteina amizina in proteina ANP v citoplazmi astrocitov.20242024-09-05 12:45:00Diplomsko delo/naloga160916sl