Vpliv proteina TDP-43 na retrotranspozicijo LINE-1 v sesalskih celičnih kulturahKorošec, Tinkara (Avtor) Župunski, Vera (Mentor) retrotranspozicijaLINE-1TDP-43HEK293TFlp-In 293Mobilni elementi DNA prispevajo k preoblikovanju genoma in evoluciji. Zaporedja, ki so zaradi njih nastala, zajemajo 45 % človeškega genoma. Pri človeku je edini aktivni mobilni element LINE-1, ki ga uvrščamo med retrotranspozone brez dolgih končnih ponovitev. Retrotranspozoni LINE-1 so zmožni avtonomne premestitve, prav tako sodelujejo tudi pri neavtonomnih premestitvah drugih. Njihovo zaporedje vsebuje dva delujoča smerna bralna okvirja, ki zapisujeta proteina ORF1p, ORF2p in protismerni zapis za ORF0. Protein ORF1p se veže na RNA in deluje kot šaperon. Protein ORF2p ima endonukleazno in reverznotranskriptazno aktivnost. Le skupaj omogočata uspešno retrotranspozicijo, saj v primeru mutacije ali utišanja enega ta ne poteče. Premestitve LINE-1 v genomu povzročajo genetsko nestabilnost in so vzrok za veliko bolezni, med drugimi tudi za nevrodegenerativna obolenja. Da bi odkrili nove, učinkovitejše načine zdravljenja, sta ključna razumevanje molekularnega procesa retrotranspozicije in poznavanje molekul, ki v procesu sodelujejo, ter drugih, ki z njimi interagirajo. V okviru diplomske naloge smo določali vpliv proteina TDP-43 na retrotranspozicijo LINE-1. Protein TDP-43 je povezan z nevrodegenerativnimi boleznimi, saj njegovo kopičenje v citoplazmi v obliki agregatov povzroči smrt nevronov. V sesalskih celičnih linijah HEK293T smo spremljali retrotranspozicijo LINE-1 z vektorjem, ki ob uspešni retrotranspoziciji omogoča sintezo zelenega fluoroscenčnega proteina. Število zelenih celic smo prešteli s pretočnim citometrom. Retrotranspozicija je potekla povprečno v 10 % celic. S tehnikami prenosa western ter imunodetekcije smo dokazali uspešnost transfekcije. Z mikroskopijo smo določili, da je ta bila 93-%. Celice HEK293T smo transficirali tudi z vektorjem z zapisom za človeški protein TDP-43. V prvem eksperimentu je bilo zmanjšanje deleža retrotranspozicije LINE-1 v celicah HEK293T v odvisnosti od TDP-43 29-%. Ko smo izvedli še drugo tehnično ponovitev, rezultati niso bili statistično značilni. Za zanesljiv rezultat bi morali izvesti še vsaj eno biološko ponovitev poskusa.20242024-09-05 10:55:01Diplomsko delo/naloga160900sl