​Izražanje PD-1 in PD-L1 na neoplastičnih in reaktivnih limfocitih v bezgavkah bolnikov z difuznim velikoceličnim limfomom BČas Slak, Teja (Avtor) Kloboves Prevodnik, Veronika (Mentor) difuzni velikocelični limfom Bimunohistokemijapretočna citometrijaPD-1PD-L1imunske celice v tumorskem mikrookoljuUvod: Difuzni velikocelični limfom B, brez drugih oznak (DVCLB, BDO), je najpogostejši tip zrelega limfoma B. Zaradi heterogene genetske slike predstavlja terapevtski izziv. Približno 35% primerov DVCLB, BDO, se ne odziva na standardno zdravljenje, kar vodi v ponovitev ali neodzivnost bolezni na zdravljenje in posledično smrtnost. V zadnjih letih so se pojavile nove terapije, zlasti imunoterapije, ki ponujajo potencialne rešitve za bolnike z DVCLB, BDO, zlasti tiste z neodzivno boleznijo na zdravljenje ali recidivno boleznijo. Vključitev imunoterapije, preko imunskih stikal PD-1/PD-L1, v standardne protokole zdravljenja DVCLB, BDO je še vedno negotova. Pri DVCLB, BDO so opazili povišane ravni izražanja PD-1 in PD-L1, ki vplivajo na delovanje imunskih celic in rast tumorja, podatki o njunem napovednem pomenu pa si nasprotujejo. Namen: Zdravljenje z blokado imunskih stikal PD-1 in PD-L1 postaja vse pogostejše pri zdravljenju različnih neoplazem. Veliko obetajo tudi pri zdravljenju limfomov, kjer pa je velik primanjkljaj podatkov o izražanju PD-1 in PD-L1 na limfomskih celicah (LC) in imunskih celicah v tumorskem mikrookolju (ang. tumor-immune cells, TIC). V naši raziskavi smo preučili izražanje PD-1 in PD-L1 na LC, in drugih TIC (reaktivnih limfocitih, makrofagih, monocitih in celicah NK) ter preverili ali lahko to vpliva na potek bolezni. Materiali in metode: V raziskavo smo vključili bolnike s primarnim DVCLB, BDO, ki so se zdravili na Onkološkem inštitutu Ljubljana (OIL) med februarjem 2004 in avgustom 2022. Bolniki so bili starejši od 18 let, bili so negativni za virus človeške imunske pomanjkljivosti (HIV) in Epsten-Barr virus. Bolniki so bili zdravljeni s standardno imunokemoterapijo, ob morebitnem ostanku bolezni še z radioterapijo. Klinično-patološke značilnosti smo pridobili iz bolnišničnega informacijskega sistema. Raziskavo smo razdelili na dva dela retrospektivni in prospektivni del. V retrospektivni del so bili vključeni vzorci 283 bolnikov z diagnozo DVCLB, BDO (podtipa B-celičnega profila germinalnega centra (GCB) in podtipa aktivirani B-celični profil (ABC)), ki so imeli biopsijo bezgavke in histološki pregled zaradi suma na limfom. Iz arhiva smo pridobili histološke preparate pobarvane s hematoksilinom in eozinom ter imunohistokemične (IHK) preparate potrebne za postavitev diagnoze. Iz tkivnih blokov smo pripravili tkivne mikromreže, ki smo jih nato pobarvali z dvojnim barvanjem PD-1/PAX5 ter PD-L1/PAX5. Z rjavim kromogenom smo označili PD-1 ali PD-L1, medtem ko smo z rdečim kromogenom prikazali PAX5. Klinične značilnosti ter izražanje PD-1 in PD-L1 na LC in TIC smo povezali s preživetjem brez napredovanja (PBN) in celotnim preživetjem (CP). V prospektivni del raziskave smo vključili 34 bolnikov od katerih smo v pregled dobili biopsijo bezgavke zaradi suma na limfom. Tkivo smo fiksirali in vklopili v parafin, nato pa smo izvedli standardna IHK barvanja potrebna za postavitev diagnoze ter odrezali še dve dodatni tkivni rezini, ki smo ju uporabili za dvojno barvanje PD-1/PAX5 in PD-L1/PAX5. Pri sprejemu biopsije bezgavke smo odvzeli še majhen košček tkiva v celični medij. Tega smo dezintegrirali in pripravili celično suspenzijo. To smo uporabili za pretočno citometrične (PC) meritve in za pripravo celičnega bloka. Za proučevanje izražanja PD-1 in PD-L1 na TIC in LC smo uporabili 3 ločene panele protiteles, kjer smo proučevali limfomske celice, limfocite B, limfocite T, NK celice, monocite in makrofage. Rezultati: Analiza retrospektivnih rezultatov izražanja PD-1 in PD-L1 na LC in TIC je razkrila, da je bil PD-1 izražen na TIC v 38,4 %, na LC pa v 8,8 % primerov, PD-L1 pa na TIC v 46,8 %, na LC pa v 6,5 % primerov. PD-L1 je pogosteje izražen na LC pri bolnikih z ABC podtipom. Opazili smo tudi, da imajo bolniki brez izražanja PD-L1 na LC daljši PBN. Z multivariantno analizo smo dokazali, da IPI indeks in izražanje PD-L1 na LC statistično značilno vplivata na PBN. Pri oceni CP je imela starost bolnikov najpomembnejšo vlogo. Prospektivni del raziskave je bil predvsem metodološki, kjer smo primerjali izražanje PD1 in PD-L1 s PC, IHK na tkivnih blokih in IHK na celičnih blokih. Pretočna citometrična analiza je pokazala prevlado limfocitov T, na katerih je bilo izražanje PD-1 bilo najvišje, PD-L1 se je najpogosteje izražal na makrofagih in monocitih. Razlik v izražanju med podtipoma ABC in GCB podtipom nismo dokazali. V IHK analizi smo ugotovili, da je bilo izražanje PD-L1 pogostejše pri ABC podtipu. Pri primerjavi rezultatov med IHK na tkivnih in celičnih blokih smo ugotovili zelo dobro do odlično ujemanje med metodami za določanje PD-1 na LC in TIC ter zadovoljivo ujemanje za PD-L1 na TIC. Pri primerjavi rezultatov PC in IHK na tkivnih blokih smo opazili zadovoljivo ujemanje pri določanju PD-1 na TIC in PD-L1 na TIC, pri primerjavi PC z IHK na celičnih blokih pa ujemanje v izražanju PD-L1 na TIC. Zadovoljivo ujemanje rezultatov med vsem tremi metodami je bilo pri določanju PD-1 in PD-L1 na TIC. Zaključek: PD-1 in PD-L1 sta izražena na LC in TIC bolnikov z DVCLB, BDO. Pokazali smo povezavo med izražanjem PD-L1 na LC in krajšim časom PBN, ki je značilno predvsem za ABC podtip DVCLB, BDO. Dvojno IHK barvanje s PAX5 se je izkazalo kot učinkovita metoda za vrednotenje izražanja PD-1 in PD-L1, saj omogoča zanesljivo razlikovanje med LC in TIC. PC metoda se je izkazala za uporabno in natančno, ki nam omogoča še analizo podpopulacij TIC. Pri primerjavi IHK na tkivnih blokih in celičnih blokih smo dobili primerljive rezultate za PD-1 na LC in TIC, za PD-L1 na TIC. Ujemanje smo dokazali tudi v primerjavi PC in IHK tkivnih blokov za PD-1 in PD-L1 na TIC, ter PD-L1 na TIC pri primerjavi PC in IHK na celičnih blokih. Pri primerjavi vseh treh metod hkrati smo zadovoljivo ujemanje dokazali pri določanju PD-1 in PD-L1 na TIC.20242024-07-18 08:59:33Doktorsko delo/naloga159688sl