Preurejanje genomov vrst rodu Brassica z uporabo Cas9 ribonukleoproteinskih kompleksovMestinšek Mubi, Špela (Avtor) Murovec, Jana (Mentor) CRISPR/Cas9ribonukleoproteinski kompleksiRNPmikrosporeprotoplastipreurejanje genomovBrassicaTehnologija CRISPR/Cas9 predstavlja ogromen potencial za žlahtnjenje rastlin in rastlinsko biotehnologijo, saj omogoča natančno spreminjanje nukleotidnega zaporedja endogenih genov in regulacijo njihovega izražanja. Tehnologija je najbolj uporabljena za induciranje mutacij zaradi svoje preprostosti, vsestranskosti, učinkovitosti in specifičnosti. V raziskavi smo uporabili mikrospore in protoplaste petih vrst iz rodu Brassica, z namenom razvoja metode preurejanja genomov z uporabo plazmidov in ribonukleoproteinskih kompleksov (RNP), ki so sestavljeni iz encima Cas9 in enojne vodilne molekule RNA, kateri ne vključujejo koraka stabilne transformacije rastlin. Na mikrosporah smo izvedli poskuse mikrosporne embriogeneze in regeneracije rastlin s tretiranjem celic z abscizinsko kislino in butionin sulfoksiminom za izboljšano regeneracijsko sposobnost, ter kolhicinom z namenom podvojevanja kromosomov in pridobivanja podvojenih haploidnih rastlin, katerih ploidnost smo določevali s pretočno citometrijo. Iz izoliranih protoplastov smo preverjali regeneracijsko sposobnost poganjkov. V mikrospore in protoplaste smo s polietilen glikolom (PEG) in elektroporacijo vnašali plazmide brez ali z geni za CRISPR/Cas9 ter RNP z zapisom za gen FRIGIDA. Uspešnost vnosa plazmidnih vektorjev v protoplaste smo določevali s pretočnim citometrom. Za detekcijo indel mutacij smo uporabili sekvenciranje naslednje generacije. Delež induciranih indel mutacij je pri transformaciji mikrospor s plazmidi ali RNP znašal do 0,03 %, po transformaciji protoplastov z vnosom RNP do 6,00 % in do 2,41 % pri vnosu plazmidnih vektorjev.20242024-07-06 07:16:05Doktorsko delo/naloga159316sl