Ovrednotenje razporejanja FUS$^{p-Y526}$ v celicah SH-SY5Y-mSc-FUS po izpostavitvi oksidativnemu stresuVukšinić, Ivana (Avtor) Rogelj, Boris (Mentor) nevrodegeneracijaprotein FUSkinaza c-Srcstresne granuleoksidativni stresFUS je protein, ki se pretežno nahaja v jedru in v celici regulira prepisovanje, procesiranje in transport molekul mRNA. V neugodnih razmerah se sekvestrira v stresne granule, s čimer celica začasno zaustavi energetsko potraten proces sinteze manj pomembnih proteinov. Iz stresnih granul se lahko zaradi delovanja nepoznanih mehanizmov razvijejo za celico škodljivi netopni agregati. Toksične agregate proteina FUS najdemo v možganih bolnikov z amiotrofično lateralno sklerozo (ALS) in frontotemporalno demenco (FTD), pri čemer se mehanizem njihovega nastanka med boleznima razlikuje. Pri ALS citoplazemski agregati vsebujejo mutiran protein FUS, pri FTD pa FUS divjega tipa. Eden izmed možnih vzrokov za nenormalno agregacijo proteina FUS pri FTD so posttranslacijske modifikacije, med drugim fosforilacija Y526 v jedrnem lokalizacijskem signalu (NLS), ki otežuje njegovo vezavo na jedrni receptor transportin-1 in prenos v jedro. Tirozine v proteinu FUS fosforilirajo kinaze družine Src, ki se aktivirajo med oksidativnim stresom. Da bi preverili, kako kinaza c-Src vpliva na znotrajcelično razporejanje proteina FUS, smo gojili tri celične linije SH-SY5Y Flp-In, ki so inducibilno izražale protein mScarlet, mScarlet v fuziji s proteinom FUS in mScarlet v fuziji s proteinom FUSΔNLS, ki ni vseboval jedrnega lokalizacijskega signala. Opazili smo, da oksidativni stres, ki ga povzroči dodatek arzenita, sproži nastanek FUS-pozitivnih stresnih granul v citoplazmi, ki so bile v največjem številu prisotne v celicah SH-SY5Y-mSc-FUSΔNLS. Te namreč izražajo za agregacijo najbolj dovzeten protein FUSΔNLS. Po transfekciji s konstitutivno aktivno kinazo c-Src so največ FUS-pozitivnih granul vsebovale celice SH-SY5Y-mSc-FUS, kar kaže na to, da fosforilacija proteina FUS pospešuje njihov nastanek. Ker komercialno protitelo proti FUS ne prepozna vseh fosforiliranih molekul FUS, bi FUS-pozitivne granule lahko predstavljale FUS, ki se je že defosforiliral v postopku zorenja stresnih granul. Ugotovili smo tudi, da kinaza c-Src med stresom lahko vpliva na stabilnost stresnih granul. Zaradi vpliva proteina FUSp-Y526 na dinamiko stresnih granul bi kinaze Src v prihodnosti lahko predstavljale pomembne terapevtske tarče v procesu zdravljenja nevrodegenerativnih bolezni.20242024-07-05 10:05:06Diplomsko delo/naloga159297sl