Kloniranje smernih in protismernih ponovitev GGGGCC v vektor pGINTŠpehar, Pia (Avtor) Župunski, Vera (Mentor) amiotrofična lateralna sklerozavektor pGintsmerne in protismerne ponovitve GGGGCCreporterski sistemAmiotrofična lateralna skleroza (ALS) je progresivna nevrodegenerativna bolezen, ki prizadene motorične nevrone centralnega živčnega sistema. Bolezen so do sedaj povezali z mutacijami več kot 50 genov, izmed katerih je najbolj pogosta mutacija na genu C9ORF72 (odprt bralni okvir 72 kromosoma 9). Ta mutacija povzroči povečanje števila ponovitev GGGGCC (G$_4$C$_2$) v prvem intronu gena, kar vodi v tvorbo netopnih skupkov RNA prepisov teh ponovitev v jedru (angl. RNA foci), sekvestracijo RNA-vezavnih proteinov in sintezo proteinov z dipeptidnimi ponovitvami (DPR). V okviru diplomskega dela smo želeli pripraviti reporterski sistem, s pomočjo katerega bi lahko detektirali smerne in protismerne ponovitve GGGGCC v človeških celičnih kulturah. Če bi v celici zaznali fluorescenco, bi to pomenilo, da so v celici prisotne ponovitve oziroma njihovi prepisi RNA. Uporabili smo vektor pGint, v katerega smo želeli vnesti različno število smernih in protismernih ponovitev in tako ustvariti naš reporterski sistem. Najprej smo v vektor pGint z mestno-specifično mutagenezo vnesli prepoznavno mesto za restriktazo HindIII, nato namnožili vektorje, ki so vsebovali zapis za ponovitve 8×G$_4$C$_2$, 24×G$_4$C$_2$, 48×G$_4$C$_2$, 8×C$_4$G$_2$, 24×C$_4$G$_2$ in 32×C$_4$G$_2$, in iz njih te ponovitve izrezali. Ponovitve smo nato preko restrikcijskih mest za restriktazi BamHI in HindIII vnesli v mutiran pGint. Kljub težavam pri izolaciji ponovitev, nam je uspelo pripraviti pGint, ki je v intronski regiji znotraj zapisa za EGFP vseboval smerne oziroma protismerne heksanukleotidne ponovitve.20242024-07-05 10:05:01Diplomsko delo/naloga159296sl