Učinek glukoze in z AMP aktivirane protein kinaze na izražanje podenot Na+,K+-ATPaze v skeletnomišičnih celicahVidović, Anja (Avtor) Pirkmajer, Sergej (Mentor) Chibalin, Alexander (Komentor) Na+K+-ATPazaglukozaAMPKskeletnomišične celiceenergijski stresCILJI: Glavni cilj raziskave je bil ugotoviti, ali in kako razpoložljivost glukoze in AMPK vplivata na izražanje podenot Na+,K+-ATPaze (NKA) v kulturah skeletnomišičnih celic. Specifični cilji so bili: (1) določiti, ali glukoza vpliva na izražanje specifičnih izooblik podenot NKA; (2) odkriti transkripcijske faktorje, ki sodelujejo pri uravnavanju izražanja podenot NKA preko glukoze; (3) opredeliti pomen aktivacije AMPK pri uravnavanju izražanja podenot NKA. HIPOTEZE: Preverili smo naslednje tri hipoteze: (H1) Glukoza uravnava izražanje specifičnih izooblik podenot NKA v skeletnomišičnih celicah. (H2) Na glukozo občutljivi transkripcijski faktorji vplivajo na izražanje podenot NKA v skeletnomišičnih celicah. (H3) AMPK uravnava vsebnost podenot NKA v skeletnomišičnih celicah. METODE: Poskuse smo izvedli na standardnih modelih, ki se uporabljajo za raziskave skeletnih mišic in vitro: podganje L6 skeletnomišične celične linije in primarne kulture človeških skeletnomišičnih celic (HSMC). Izražanje podenot NKA smo ocenili z uporabo kvantitativne reakcije s polimerazo v realnem času (qPCR) in odtisom western. Za oceno vloge AMPK pri uravnavanju NKA smo uporabili utišanje genov. REZULTATI: Ad H1: Da bi raziskali vpliv glukoze na izražanje podenot NKA, smo izvedli poskuse na podganjih L6 celicah in HSMC pri različnih koncentracijah glukoze (0 mM, 5,5 mM in 25 mM). V celicah L6 je pomanjkanje glukoze zvečalo izražanja NKA?1 in NKA?2 na ravni proteinov, s podobnimi spremembami na ravni NKA?1 mRNA. Nasprotno pa se je izražanje NKA?2 mRNA v odsotnosti glukoze zmanjšalo. V HSMC se je raven proteinov NKA?1 povečala pri visoki glukozi, medtem ko je NKA?2 ostala nespremenjena. Ad H2: Tretiranje podganjih mišičnih cevčic s 5,5 mM koncentracijo glukoze je v primerjavi s pomanjkanjem glukoze in visoko koncentracijo glukoze zvečalo izražanja proteina Sp1 in proteina ZEB1 na ravni mRNA. Po drugi strani pa je tretiranje podganjih cevčic s 25 mM koncentracijo glukoze znižalo izražanje Mondo A in proteina ATF1 na ravni mRNA. ATF1 je bil znižan tudi pri koncentraciji glukoze 5,5 mM. Poleg tega je pomanjkanje glukoze znižalo izražanje proteina REST na ravni mRNA, tako pri koncentraciji glukoze 5,5 mM kot 25 mM. Pri HSMC je bila edina pomembna razlika v izražanju mRNA kot odziv na različne koncentracije glukoze opažena pri ChREBP, ki se je v odstotnosti glukoze povečala. Ad H3: L6 mišične cevčice smo 24 ur tretirali z AICAR in A-769662. Aktivatorja AMPK sta zmanjšala vsebnost proteinov NKA?1 in NKA?2, kar je bilo skladno z izražanjem na ravni mRNA. Prav tako smo z aktivatorji AMPK zaznali zmanjšano izražanje FXYD1 na ravni mRNA. Da bi raziskali vpliv AMPK na NKA, smo na L6 cevčicah utišali gena AMPK?1/?2 in kot rezultat se je raven proteina NKA?1 povečala pri koncentraciji glukoze 5,5 mM. V odsotnosti glukoze se je raven proteina NKA?2 zmanjšala po utišanju AMPK?1/?2. Pri HSMC je bilo izražanje NKA?1 mRNA v utišanih celicah AMPK?1/?2 povečano pri koncnetraciji glukoze 5,5 mM, skupaj z zmanjšanjem NKAß1 in NKAß2 mRNA. ZAKLJUČKI: (1) Glukoza uravnava izražanje specifičnih izooblik podenot NKA v celicah L6 in HSMC, kar potrjuje našo prvo hipotezo. (2) Naša raziskava posredno nakazuje, da je izražanje mRNA nekaterih transkripcijskih dejavnikov (Sp1, ZEB1, ATF1 in REST v L6 celicah in ChREBP v HSMC) odzivno na glukozo, kar ima lahko vlogo pri vplivu na izražanje podenot NKA v skeletnomišičnih celicah. Naše druge hipoteze ne moremo niti potrditi niti zavreči. (3) V celicah L6, AMPK uravnava podenote NKA na ravni proteinov in mRNA, z načinom, odvisnim od posamezne izooblike. Poleg tega je AMPK negativni regulator FXYD1 v celicah L6. Naši rezultati podpirajo tretjo hipotezo.20242024-07-04 07:15:07Doktorsko delo/naloga159216sl