Epitopi poglavitnega alergena ose Ves v 5 in asimptomatska IgE senzibilizacija za pik oseDebeljak, Jerneja (Avtor) Košnik, Mitja (Mentor) Korošec, Peter (Komentor) alergen Ves v 5B-celični epitopibakteriofagne predstavitvene knjižnicesekvenciranje naslednje generacije (NGS)asimptomatska senzibilizacijaUVOD: V doktorski nalogi smo identificirali epitope alergena Ves v 5, ki je poglavitni alergen strupa ose; kar pomeni, da je odgovoren za večino alergij, ki se pojavijo kot posledica osjega pika. Epitopi alergena igrajo ključno vlogo v procesu alergijske reakcije, saj predstavljajo mesto vezave protiteles IgE, kar posledično vodi do degranulacije efektorskih celic in pojava simptomov alergijske reakcije. Alergeni vsebujejo na svoji površini epitope in medtem ko za detekcijo protiteles IgE v serumu zadostuje že prisotnost monovalentne vezave protitelesa IgE in alergena, pa mora za degranulacijo efektorskih celic in posledično za pojav simptomov alergijske reakcije priti do prekrižanja vsaj dveh, na receptor vezanih protiteles IgE. Identifikacija in poznavanje epitopov alergena je tako ključnega pomena za razvoj novih diagnostičnih testov in novih načinov imunoterapije. Imunoterapija z uporabo epitopov se pojavlja kot potencialna alternativa trenutno uporabljeni imunoterapiji, saj imajo sintetični peptidi določene prednosti pred uporabo celotnih alergenskih ekstraktov, kot so na primer pridobivanje pod standardiziranimi pogoji, enostavna izolacija in stabilnost v liofilizirani obliki. Identifikacija epitopov je, zaradi napredka tehnologije sekvenciranja naslednje generacije (NGS) in razvoja novih bioinformatskih orodij za analizo podatkov bakteriofagnih predstavitvenih knjižnic ter interakcij protein-peptid, doživela velik napredek in omogočila pridobitev zanesljivejših rezultatov. METODE: Za identifikacijo B-celičnih epitopov smo se poslužili tehnologije bakteriofagnega prikaza, kjer smo uporabili tri bakteriofagne knjižnice s peptidi, dolgimi 7 oziroma 12 aminokislin. Selekciji peptidov, ki vežejo poliklonska protitelesa anti-Ves v 5 IgG, je sledilo sekvenciranje NGS in bioinformatska analiza pridobljenih podatkov (z uporabo orodij PuLSE, R, SAROTUP, MEME, Hammock in WebLogo). Rezultate smo primerjali z že identificiranimi epitopom-podobnimi peptidi, objavljenimi v spletni bazi IEDB. Za vizualizacijo epitopskih regij na alergenu smo uporabili orodji Pepitope in Pymol. Z uporabo peptidne mikromreže smo ovrednotili vezavo protiteles IgE iz 36-ih serumov za pik ose simptomatskih in 36-ih serumov za pik ose asimptomatskih posameznikov na izbrane epitopom-podobne peptide z namenom analizirati, ali protitelesa različnih skupin posameznikov vežejo druge epitope. Uporabili smo tako linearno kot ciklično obliko epitopom-podobnih peptidov. REZULTATI: V prvem delu smo identificirali epitopom-podobne peptide in posledično poglavitne epitopske regije alergena. Poglavitni aminokislinski motivi identificiranih treh epitopskih regij so sestavljeni iz aminokislin TKQE, GKI oziroma KPN. V spletni bazi že identificiranih epitopov smo našli 42 objav za alergen Ves v 5, ki pa se nanašajo na T-celične epitope. Medtem ko se motiva TKQ(E) in KPN v omenjenih objavah večkrat pojavita, objave za motiv GKI zaenkrat še ni zaslediti. Z analizo peptidnih mikromrež smo ugotovili, da se protitelesa v 7/12 primerov signifikantno bolje vežejo na linearne peptide in v 2/12 na ciklične (v treh vzorcih ni bilo razlike). Protitelesa IgE se tudi v primerjavi z motivom GKI signifikantno bolje vežejo na peptide z motivoma TKQE (p < 0,001) ali KPN (p < 0,001). Inkubacija serumov simptomatskih in asimptomatskih posameznikov z identificiranimi epitopom-podobnimi peptidi nam je razkrila, da tako simptomatiki kot asimptomatiki prepoznajo iste epitopske regije, vendar se določeni identificirani epitopom-podobni peptidi razlikujejo med simptomatskimi in asimptomatskimi posamezniki. Večjo razliko smo opazili pri afiniteti vezave, saj asimptomatiki signifikantno bolje vežejo epitopom-podobne peptide tako v linearni kot ciklični obliki (p = 0,001). ZAKLJUČEK: V predstavljenem doktorskem delu smo vpeljali nov protokol identifikacije epitopov z implementacijo tehnologije NGS in bioinformatskimi orodji, kar nam je omogočilo identifikacijo treh epitopskih regij na alergenu Ves v 5. Uporaba identificiranih epitopov za razločevanje med simptomatsko in asimptomatsko senzibilizacijo je v našem primeru pokazala, da simptomatiki in asimptomatiki prepoznavajo iste epitopske regije na alergenu, razlikujejo pa se v prepoznavi stranskih aminokislin (aminokisline, ki prispevajo manjši delež vezavne energije) in v sami afiniteti vezave. Za razjasnitev pomena pridobljenih rezultatov so potrebne nadaljnje raziskave.20242024-05-30 07:15:49Doktorsko delo/naloga158212sl