Priprava in karakterizacija rekombinantnih enoverižnih fragmentov protiteles proti proteinom LARS, HARS, FUS in MATR3Sotlar, Pia (Avtor) Župunski, Vera (Mentor) scFvamiotrofična lateralna sklerozaaminoacil-tRNA-sintetazeFUSMATR3Rekombinantni enoverižni fragment protitelesa (scFv) je genetska fuzija variabilne domene lahke verige protiteles IgG (VL) in variabilne domene težke verige protiteles IgG (VH). Njihova molekulska masa je od 25 do 30 kDa, kar jim daje določene prednosti, zaradi katerih jih uporabljamo za zdravljenje in diagnosticiranje bolezni. Med te spada amiotrofična lateralna skleroza (ALS), nevrodegenerativna bolezen, ki prizadene zgornje in spodnje motorične nevrone. Med proteine, ki so povezani z ALS, spadata tudi proteina spojen v sarkomu (FUS) in matrin 3 (MATR3). Mutacije v genih FUS in MATR3 med drugimi povzročajo moten transport proteinov med jedrom in citoplazmo, posledica česar je nastanek proteinskih agregatov v citoplazmi. K nastanku teh agregatov in samemu razvoju ALS pa pripomore tudi vpliv aminoacil-tRNA-sintetaz (aaRS), ki so ključne pri procesu translacije. V sklopu diplomskega dela smo želeli z uporabo ekspresijskega sistema E. coli izraziti scFv-je proti proteinom, ki so vpleteni v ALS, Z-FUS-5 in Z-MATR3-4 ter scFv-je proti aminoacil-tRNA-sintetazam, O-LARS-15 in J-HARS-4. Najprej smo kompetentne celice E. coli BL21[DE3] transformirali z vektorji. Izražanje smo nato inducirali z dodatkom IPTG-ja in scFv-je izolirali iz periplazme, saj so vsebovali signalno zaporedje iz proteina zunanje membrane A (ompA). Ker so vsi scFv-ji vsebovali haksahistidinsko oznako, smo za izolacijo uporabili nikljevo afinitetno kromatografijo. Po izolaciji smo scFv-ja Z-FUS-5 in Z-MATR3-4 dodatno okarakterizirali s točkovnim prenosom. Ugotovili smo, da omenjena scFv-ja prepoznata proteina FUS in MATR3 v denaturirani in nedenaturirani obliki.20242024-05-17 13:15:13Diplomsko delo/naloga156300sl