<?xml version="1.0"?>
<rdf:RDF xmlns:rdf="http://www.w3.org/1999/02/22-rdf-syntax-ns#" xmlns:dc="http://purl.org/dc/elements/1.1/"><rdf:Description rdf:about="https://repozitorij.uni-lj.si/IzpisGradiva.php?id=155144"><dc:title>Vrednotenje fuzijskega poročevalskega kompleksa mCherry in proteaze kaminizin v bakteriji Streptomyces rimosus</dc:title><dc:creator>Nusdorfer,	Teja	(Avtor)
	</dc:creator><dc:creator>Petković,	Hrvoje	(Mentor)
	</dc:creator><dc:creator>Bahun,	Miha	(Komentor)
	</dc:creator><dc:subject>streptomicete</dc:subject><dc:subject>Streptomyces rimosus</dc:subject><dc:subject>heterologno izražanje</dc:subject><dc:subject>kaminizin</dc:subject><dc:subject>mCherry</dc:subject><dc:subject>fuzijski protein</dc:subject><dc:subject>fluorescenca</dc:subject><dc:subject>proteolitična aktivnost</dc:subject><dc:description>Proteaza kaminizin izolirana iz arheje Aeropyrum camini spada v skupino subtilizinu podobnih proteaz. Glede na aminokislinsko zaporedje je zelo podobna že karakterizirani proteazi pernizin iz arheje Aeropyrum pernix. Ta lahko razgrajuje prionske proteine. Zaradi nizkih donosov in ekstremnih pogojev rasti je pridobivanje proteaze s pomočjo arheje A. camini v večjem merilu praktično nemogoče. V okviru magistrskega dela smo kot gostiteljski organizem za heterologno izražanje fuzijskega kompleksa fluorescentnega proteina mCherry in kaminizina uporabili bakterijo Streptomyces rimosus. Predhodno konstruirane plazmidne vektorje za izražanje rekombinantnih proteinov kaminizin, pro-kaminizin, mCherry-kaminizin in mCherry-pro-kaminizin v bakteriji S. rimosus (pAB04_ermE*_srT_kaminizin / pro-kaminizin / mCherry-kaminizin / mCherry pro-kaminizin_AC CO HT) smo z elektroporacijo vnesli v modificiran gostiteljski sev bakterije S. rimosus ΔOTC, pri kateri je celotna genska skupina za biosintezo oksitetraciklina odstranjena. Transformante bakterije S. rimosus smo nato gojili v različnih gojiščih in primerjali produkcijo in zunajcelično aktivnost obeh proteinov v fuzijskem proteinskem konstruktu. Prisotnost proteina mCherry smo določali z merjenjem fluorescence, aktivnost različic kaminizina pa z azokazeinskim testom. Dokazali smo korelacijo med intenziteto fluorescence in aktivnostjo kaminizina. Uspešnost izražanja rekombinantnega kaminizina smo po izolaciji encima iz supernatanta z obarjanjem s TCA oz. z nikelj-afinitetno kromatografijo ovrednotili z NaDS-PAGE, proteolitično aktivnost pa potrdili s cimografijo in azokazeinskim testom. Z afinitetno kromatografijo nismo uspeli močno koncentrirati kaminizina iz supernatanta, kar se je odražalo v nizki intenziteti lis na NaDS-PAGE gelu. S pomočjo TCA obarjanja smo izolirane celokupne zunajcelične proteine vizualizirali na NaDS-PAGE gelu in na cimogramu, pri čemer smo preverili vpliv predhodne temperaturne aktivacije na vsebnost proteinov. Dokazali smo, da ima fuzijski protein mCherry-kaminizin enako proteinazno aktivnost kot sam kaminizin. Preverili smo tudi vpliv različnih temperatur, vrednosti pH in koncentracije NaDS na aktivnost kaminizina. Ugotovili smo, da je aktivnost kaminizina najvišja pri temperaturi 80 °C in pH 8,0.</dc:description><dc:date>2024</dc:date><dc:date>2024-03-21 11:52:37</dc:date><dc:type>Magistrsko delo/naloga</dc:type><dc:identifier>155144</dc:identifier><dc:language>sl</dc:language></rdf:Description></rdf:RDF>