Določanje RNA tarč SNORD116 z metodo COMRADESPečarič Strnad, Urška (Avtor) Rogelj, Boris (Mentor) snoRNASNORD116Prader-Willijev sindromCOMRADESprečno povezovanje RNApsoralen-TEG azidVelika večina RNA molekul je nekodirajočih in imajo drugačne, a pomembne funkcije. Med te spadajo tudi snoRNA, ki so majhne, nekodirajoče RNA, ki se kopičijo v jedrcu in usmerjajo posttranskripcijske modifikacije mnogih drugih RNA molekul. Glede na značilna ohranjena zaporedja snoRNA delimo v dve podskupini, in sicer SNORD in SNORA. V tej nalogi smo se osredotočili na molekule SNORD oz. male nukleolarne RNA s C/D ohranjenim zaporedjem. Velika večina teh RNA vodi 2' O metilacijo ribosomske RNA, obstajajo pa tudi take, ki nimajo znanih funkcij oz. tarč, s katerimi se povezujejo, zato jih imenujemo tudi snoRNA sirote. Med slednje sodi tudi genska gruča SNORD116, ki je opredeljena kot minimalna kritična regija Prader Willijevega sindroma (PWS). To je redka genetska nevrorazvojna motnja, ki je posledica delecije po očetu podedovanih genov na kromosomu 15 in lahko med drugim povzroči življenjsko ogrožajočo debelost. Ker je genska gruča SNORD116 odsotna pri vseh bolnikih s PWS, velja za glavni genetski dejavnik za pojav sindroma. V magistrski nalogi smo optimizirali protokol metode COMRADES, s katero smo nato želeli identificirati RNA tarče SNORD116. Metoda temelji na in vivo prečnem povezovanju RNA dupleksov s psoralen-TEG azidom, ki ob obsevanju z dolgovalovno UV svetlobo tvori kovalentne povezave med dvema verigama RNA. Temu sledi izolacija celokupne RNA iz celic in biotinilacija prečno povezanih dupleksov, ki jih nato afinitetno zajamemo s testom »pull down«. Prečno povezane fragmente ločimo s poliakrilamidno gelsko elektroforezo, nato pa z bližnjo ligacijo povežemo konca obeh prečno povezanih molekul in z obsevanjem s kratkovalovno UV svetlobo prekinemo kovalentne povezave med parom RNA verig. Nastanejo hibridne enoverižne RNA molekule, iz katerih sintetiziramo knjižnico cDNA in s sekvenciranjem ter bioinformatsko analizo poskušamo identificirati pare SNORD116 in njenih tarčnih RNA. Uspešno smo optimizirali več korakov protokola ter dodali korak obogatitve izbrane RNA, kjer s hibridizacijo z biotiniliranimi DNA-sondami in tehniko afinitetnega zajema povečamo delež SNORD116 v vzorcu in se izognemo prevelikim izgubam. Zaradi obsežnega eksperimentalnega dela naloge na koncu nismo uspeli identificirati RNA tarč SNORD116. Kljub temu bo optimiziran protokol služil kot temelj za prihodnje eksperimente, ki bodo poskušali razkriti funkcije te enigmatične genske gruče.20242024-02-16 09:05:00Magistrsko delo/naloga154479sl