Vpliv označevalcev CD9 in TRIM28 na preživetje bolnikov z glioblastomomPorčnik, Andrej (Avtor) Velnar, Tomaž (Mentor) Lah Turnšek, Tamara (Komentor) biološka označevalca TRIM28 in CD9glioblastom in njegove podvrsteglioblastomske matične celiceinvazija tumorksih celicribe cebriceOzadje: Glioblastom (GB) je eden izmed najmalignejših možganskih tumorjev s povprečnim preživetjem bolnikov zgolj 12–15 mesecev. Glavni razlogi za njegovo visoko malignost in slabo prognozo so invazivnost, heterogenost in odpornost glioblastomskih matičnih celic (GMC) na zdravljenje. Opredelitev bioloških označevalcev GMC in natančnejša razdelitev GB v podvrste bi lahko doprinesli k boljšemu poznavanju bolezni in učinkovitejšemu zdravljenju bolnikov. Kot možna označevalca GMC sta bila v nedavnih raziskavah prepoznana tetraspanin CD9 in transkripcijski dejavnik TRIM28. Metode: V prospektivno raziskavo smo vključili 89 bolnikov z GB, operiranih od leta 2012 do januarja 2020 na Kliničnem oddelku za nevrokirurgijo Univerzitetnega kliničnega centra Ljubljana. Opredelili smo histopatološke in molekularne značilnosti tumorjev, značilnosti zdravljenja in preživetje bolnikov. Iz vzorcev tumorja smo izolirali ribonukleinsko kislino in z verižno reakcijo s polimerazo na mikrofluidnem čipu analizirali nivoje izražanja 15 izbranih genov za opredelitev podvrst GB. S tako prilagojeno klasifikacijo po Behnanu smo vzorce GB razvrstili v klasično (CL), mezenhimsko (MES) in pronevralno (PN) podvrsto. Preostale vzorce GB, ki kriterijev za uvrstitev v omenjene podvrste niso izpolnjevali, pa smo uvrstili v mešano (MIX) podvrsto. V GB podvrstah smo določili nivo izražanja genov CD9 in TRIM28 ter preverili njun vpliv na preživetje bolnikov. Vzpostavili smo tudi celične linije tumorskih celic, ki so bile pridobljene iz biopsij tumorjev. Preverili smo vpliv ciljanja označevalcev CD9 in TRIM28 na rast človeških GMC in GB celic in vivo na modelu zarodkov rib cebric. Označevalec TRIM28 smo zavirali z nanoprotitelesom NB237, gen CD9 pa smo utišali z lentivirusnim vektorjem. Z invertnim fluorescentnim mikroskopom smo prvi in tretji dan po vsaditvi celic v možgane zarodkov rib cebric opredelili velikost in fluorescenco tumorja ter tako in vivo določili invazijo in proliferacijo GB celic. Pri preskušanju domnev smo vrednost p < 0,05 privzeli kot statistično značilno. Rezultati: Povprečna starost bolnikov ob operaciji je bila 62 ± 13 let, 65,2 % je bilo moških. Tumor se je pogosteje nahajal v desni možganski hemisferi (56,2 %), v večini primerov je bil omejen na en reženj (82,2 %). S prilagojeno klasifikacijo po Behnanu smo GB razdelili v CL (n = 21; 23,6 %), MES (n = 5; 5,6 %) in PN (n = 7; 7,9 %) podvrsto. 62,9 % vseh GB (n = 56) ni bilo moč uvrstiti v omenjene tri podvrste, zato smo jih uvrstili v MIX podvrsto. Izražanje označevalca CD9 je bilo statistično značilno povečano v CL podvrsti v primerjavi z MES (p = 0,003) in MIX podvrsto (p < 0,001), izražanje v PN podvrsti pa v primerjavi z vsemi preostalimi ni bilo pomembno različno (vsi p > 0,05). Primerjava izražanja označevalca TRIM28 v različnih podvrstah ni pokazala statistično značilnih razlik (vsi p > 0,05). Pri vseh bolnikih je bila opravljena vsaj delna resekcija tumorja, pri 42,7 % bolnikov je bila resekcija popolna. Celokupno preživetje bolnikov z GB je bilo 14,1 mesecev (95 % interval zaupanja 11,1–17,0 mesecev). Kot neodvisna napovedna dejavnika preživetja sta se izkazala obseg resekcije tumorja (nepopolna vs. popolna odstranitev: razmerje ogroženosti 2,42; 95 % interval zaupanja 1,40–4,20) in pooperativna ocena zmogljivosti bolnika po Karnofskem (? 70 vs. < 70: razmerje ogroženosti 0,50; 95 % interval zaupanja 0,27–0,95). Stopnja izražanja označevalcev CD9 in TRIM28 ni imela vpliva na preživetje bolnikov z GB (vsi p > 0,05). Preživetje bolnikov s CL podvrsto je bilo krajše kot preživetje bolnikov z MIX podvrsto (p = 0,013), med preostalimi podvrstami pa v preživetju ni bilo značilnih razlik. In vivo v možganih zarodkov rib cebric se je po aplikaciji nanoprotitelesa TRIM28 invazija GB celic NB237 zmanjšala za 13–15 %, invazija GMC pa za 25 % (vsi p < 0,05). Invazija GMC se je v skupini s z utišanim genov CD9 zmanjšala za 20 % (p < 0,001), invazija GB celic U87 pa za 24 % (p < 0,05). Sklepi: Prilagojena klasifikacija po Behnanu, ki smo jo v raziskavi uporabili za razvrstitev GB v različne podvrste, se morda ni izkazala za optimalno, saj smo velik del tumorjev uvrstili v MIX podvrsto, kar lahko kaže na heterogenost GB. Izražanje označevalca CD9 je bilo statistično značilno povečano v CL podvrsti v primerjavi z MES in MIX podvrsto, izražanje označevalca TRIM28 pa se med podvrstami ni pomembno razlikovalo. Stopnja izražanja označevalcev CD9 in TRIM28 ni imela vpliva na preživetje bolnikov z GB. Ugotovili pa smo, da imata tako CD9 kot TRIM28 pomembno vlogo pri invaziji GB celic in GMC, ki smo jo z utišanjem gena ali ciljanjem s selektivnimi nanotelesi zmanjšali. Z raziskavo smo validirali zaviralno nanoprotitelo proti TRIM28, kar odpira vrata novim možnostim zdravljenja. Ugotovili smo, da je s kirurškega vidika predvsem pomembno stremeti k popolni resekciji GB, saj se je le-ta izkazala kot neodvisen napovedni dejavnik boljšega preživetja. Kljub vsem trenutnim možnostim zdravljenja pa ostaja GB bolezen z zelo slabo prognozo. Njegova nizka pojavnost ter velika inter- in intratumorska heterogenost, ki smo jo prikazali tudi z našimi rezultati, otežujeta njegovo raziskovanje. Med raziskavo smo v slovenskem prostoru vzpostavili biobanko GB poimenovano Gliobanka, kar nam bo omogočilo izvedbo raziskav na večjem številu vzorcev in učinkovitejše proučevanje bolezni.20242024-02-01 07:15:21Doktorsko delo/naloga154203sl