Razvoj metode za sledenje medcelične komunikacije bakterije Bacillus subtilis v mikropretočnih napravahMušič, Lana (Avtor) Mandić Mulec, Ines (Mentor) Šimunović, Katarina (Komentor) Bacillus subtilismikrofluidikazaznavanje kvorumafluorescencaV okolju se bakterije pojavljajo v obliki večceličnih struktur, ki so produkt kompleksnih medceličnih socialnih interakcij. Pomemben tip medcelične komunikacije je zaznavanje kvoruma, ki pri bakteriji B. subtilis temelji na sistemu ComQXPA. Cilj naloge je bil razviti sistem za spremljanje bakterij in njihovih interakcij v času ter na nivoju posamezne celice. V ta namen smo vzpostavili mikropretočni sistem v katerem smo gojili bakterije v 2D komorah mikrometrskih dimenzij. Spremljali smo rast in odziv bakterije B. subtilis na signalni peptid ComX z zajemanjem slik s konfokalnim mikroskopom. Najprimernejši pogoj za tovrstne raziskave je bil gojenje bakterij v definiranem gojišču CM, s hitrostjo pretoka 3 μL/min. Slednji je celicam omogočal nemoteno rast v rastnih komorah, obenem pa je preprečil razrast biofilma izven rastnih komor. Pri teh pogojih se je biomasa v rastni komori povečevala v intervalih, z vmesnimi »lag« fazami. V razponu 42,5 ur smo v rastni komori zaznali 3 faze aktivnega povečevanja biomase ter 2 vmesni fazi, med katerima ni prišlo do vidnega večanja biomase. Sočasno smo spremljali intenziteto fluorescence s pomočjo reporterja PsrfA-YFP, ki je bila pokazatelj celičnega odziva na ComX. Ob prvem zajemanju slik (3h po inokulaciji) je bil sistem za zaznavanje kvoruma že aktiven, saj smo že zaznali fluorescentni signal, ki je znašal okoli 640 r.f.u. Slednji se je dinamično vzdrževal tekom prvih 30 ur poskusa, nato pa je sočasno z naraščanjem biomase, močno narastla tudi mediana vrednost fluorescence ter ob koncu poskusa (42,5h) dosegla okoli 1300 r.f.u. V okviru magistrske naloge smo uspešno optmizirali pripravo mikročipov iz PDMS in vodenje procesa v mikropretočnem sistemu, kar je pomembno za kvalitetno izvedbo poskusov, pri katerih v času spremljamo posamezno celico. Poleg optimizacije procesa smo tudi potrdili našo hipotezo, da sta jakost in časovni interval odziva na signal ComX odvisna od hitrosti pretoka in tipa gojišča.[L. Mušič]20232023-12-19 08:08:00Magistrsko delo/naloga153130sl