Vpliv fosforilacije na znotrajcelično razporejanje proteina FUS v diferenciranih celicah SH-SY5Y FlpInGartner, Eva (Avtor) Motaln, Helena (Mentor) Rogelj, Boris (Komentor) fosforilacijaprotein FUSp-526YdiferenciacijaSH-SY5Y FlpInkinaze družine SrcAmiotrofična lateralna skleroza (ALS) in frontotemporalna demenca (FTD) sta hitro napredujoči nevrodegenerativni bolezni, za kateri je značilno postopno odmiranje nevronov. Razlog za razvoj obolenj so mutacije v različnih genih, k razvoju pa naj bi prispevale tudi posttranslacijske modifikacije RNA-vezavnih proteinov. Eden izmed takih genov je gen FUS, ki nosi zapis za istoimenski protein. Protein FUS (ang. »fused in sarcoma«) je primarno jedrni RNA/DNA vezavni protein, ki sodeluje pri številnih procesih kot so prepisovanje RNA, metabolizem RNA, odziv na poškodbe DNA in odziv na celični stres. Različne funkcije protein FUS opravlja tako v jedru kot v citoplazmi, zato mora za normalno delovanje krožiti med njima. Slednje bi mu lahko omogočala posttranslacijska modifikacija in sicer fosforilacija zadnjega tirozinskega ostanka s strani kinaz iz družine Src. V magistrskem delu smo opredelili vpliv fosforilacije C-končnega tirozinskega ostanka na mestu 526 (Y526) v proteinu FUS na znotrajcelično razporejanje proteina FUS in proteina FUS z delecijo C-končne domene, ki nosi zapis za jedrni signalizacijski signal (NLS), v diferenciranih celicah SH-SY5Y FlpIn. Uporabili smo predhodno razvite celične linije SH- SY5Y FlpIn in sicer SH-SY5Y-mSc, SH-SY5Y-mScFUS in SH-SY5Y-mScFUSdNLS. Vse tri linije celic inducibilno izražajo rdeči fluorescenčni protein mScarlet (mSc), z mScarlet označen protein FUS (mScFUS) ali z mScarlet označen protein FUS brez C-končne regije (mScFUSdNLS). Uspešnost izražanja proteinov mSc, mScFUS in mScFUSdNLS v celicah smo potrdili s fluorescenčno konfokalno mikroskopijo in detekcijo teh proteinov po prenosu western. Najprej smo s pomočjo literature in eksperimentalnega dela prilagodili diferenciacijski protokol, s katerim smo celice diferencirali v nevronom podobne celice, z dodatkom retinojske kisline in dejavnika BDNF. Izražanje proteinov, značilnih za nevronske celice, smo potrdili s fluorescenčno konfokalno mikroskopijo in detekcijo teh proteinov po prenosu western. Diferencirane celice SH-SY5Y FlpIn vseh treh celičih linij smo nato transficirali s plazmidi z zapisom za kinaze c-Src, c-Fyn in c-Abl. Za primerjavo smo transficirali tudi nediferencirane celice SH-SY5Y FlpIn. Tik pred transfekcijo smo celice inducirali z doksiciklinom, kar je spodbudilo izražanje vstavljenih mSc, mScFUS in mScFUSdNLS. Vpliv fosforilacije na znotrajcelično razporejanje proteina FUS smo ovrednotili z uporabo specifičnega protitelesa proti-FUSp-526Y. Ugotovili smo, da se fosforiliran protein FUSp-526Y v primeru izražanja aktivnih kinaz c-Src in c-Fyn nahaja predvsem v celičnem jedru, medtem ko ga v primeru izražanja aktivne kinaze c-Abl najdemo v citoplazmi. Fosforilacija proteina FUS na zadnjem tirozinskem ostanku moti običajen prenos proteina FUS med jedrom in citoplazmo. S tem potencialno vpliva na kopičenje proteina FUS v citoplazmi in nastanek toksičnih agregatov.20232023-12-18 15:05:01Magistrsko delo/naloga153122sl