Spremljanje sprememb v transmembranski napetosti po elektroporaciji celic in vitro v prisotnosti zaviralcev ionskih kanalovLeskovar, Tomaž (Avtor) Rems, Lea (Mentor) Blažič, Anja (Komentor) elektroporacijaovarijske celice kitajskega hrčka (CHO)transmembranska napetostznotrajcelični kalcijtetraetilamonij (TEA)9-hydroxyphenanthrene (9-phenantrol)Z elektroporacijo povečamo prepustnost plazemske membrane, kar nam omogoči, da v celico vnesemo ali iz nje ekstrahiramo želene učinkovine, ki plazemske membrane sicer ne prehajajo. Ta tehnika se uporablja v različnih medicinskih aplikacijah, kot so gensko zdravljenje, zdravljenje tumorjev in dostava zdravil. Uspešnost elektroporacije temelji na doseganju ravnotežja med povišanjem prepustnosti plazemske membrane in preživetjem celic. Pomembno vlogo pri preživetju celic predstavlja sposobnost celice, da obnovi mirovno transmembransko napetost in vzpostavi celično homeostazo. V nalogi smo raziskovali, kako elektroporacija vpliva na spremembe v transmembranski napetosti pri ovarijskih celicah kitajskega hrčka (CHO-K1) in kako na te spremembe vplivata zaviralec TRPM4 kanalov 9-hydroxyphenanthrene (9-phenantrol) in zaviralec kalijevih ionskih kanalov tetraetilamonij (TEA). Predpostavili smo, da bi zaviralec 9-phenantrol lahko imel vpliv na spremembe v TMN, saj so predhodne študije pokazale, da CHO celice izražajo endogene TRPM4 kanale. Zaviralec TEA pa je bil izbran kot negativna kontrola, saj CHO celice ne izražajo znatnega števila kalijevih kanalov. Elektroporacijo smo dosegli z izpostavitvijo celic enemu električnemu pulzu dolžine 10 µs, 100 µs ali 1000 µs. Amplitudo pulza smo določili na podlagi meritev vnosa kalcija v celice s pomočjo fluorescenčnega barvila Fluo4-AM. Za vsako dolžino pulza smo določili najnižjo amplitudo, pri kateri smo zaznali znatni vnosa kalcija v celice. Poleg te najnižje amplitude, ki predstavlja prag za elektroporacijo, smo izbrali še približno 2-krat višjo amplitudo. Pulze izbranih amplitud smo nato uporabili pri nadaljnjih meritvah sprememb v transmembranski napetosti. Za slednje smo uporabili potenciometrično barvilo FLIPR, katerega fluorescenca se spreminja s spremembo v TMN. Ugotovili smo, da se membrana po elektroporaciji depolarizira, vendar nobeden od testiranih zaviralcev ni imel signifikantnega vpliva na to depolarizacijo, ne glede na dolžino in amplitudo pulza. To nakazuje, da je bila depolarizacija v veliki meri povzročena zaradi neselektivnega povečanja prepustnosti membrane zaradi elektroporacije. Za lažjo interpretacijo eksperimentalnih rezultatov smo razvili teoretični model, s katerim smo preverili, v kolikšni meri bi TRPM4 kanali sploh lahko prispevali k spremembam TMN po elektroporaciji. Model je potrdil, da TRPM4 kanali nimajo bistvenega vpliva na depolarizacijo, saj se pri danih pogojih membrana povsem depolarizira že zaradi neselektivnega toka ionov prek por v elektroporirani membrani. Poskusi so razkrili še, da nizkonapetostni pred-pulz dolžine 45 ms, ki ga proži elektroporator BTX Gemini za meritev upornosti vzorca pred proženjem elektroporacijskega pulza, zmanjša fluorescenco barvila FLIPR. Mehanizmi tega vpliva niso povezani s povečanjem prepustnosti membrane in ostajajo nepojasnjeni. V nadaljnjih poskusih bi bilo priporočljivo uporabljati elektroporator, ki pred dovajanjem pulza ne proži pred-pulza, tako da celice ne bi po nepotrebnem izpostavljali stresu, ki lahko vpliva na rezultat elektroporacije. Hkrati bi bilo smiselno testirati druga barvila za merjenje sprememb v transmembranski napetosti, ki bi lahko nadomestila barvilo FLIPR.20232023-12-08 13:05:01Magistrsko delo/naloga152837sl