Proteinski ojačevalci kalcijeve signalizacije v sesalskih celicahJazbec, Vid (Avtor) Benčina, Mojca (Mentor) Kalcijeva signalizacijaultrazvokplinski vezikliumetna celična vezjaNadzor nad delovanjem celic predstavlja eno glavnih področij sintezne biologije. Vsestranskost kalcijevih ionov v celičnih procesih ponuja možnosti natančnega uravnavanja mnogih celičnih lastnosti in funkcij. Pomembna lastnost kalcijeve signalizacije je tudi dejstvo, da lahko vnos kalcija povzročimo z neinvazivnimi metodami, ko sta ultrazvok in segrevanje. Uravnavanje koncentracije kalcijevih ionov je za delovanje celic zelo pomembno. Ker s kemično ali fizikalno stimulacijo posegamo v to ravnovesje, se celica na to odziva in onemogoča preprosto stimulacijo. V okviru dela smo razvili sistem za uravnavanje vnosa kalcijevih ionov v celico na osnovi proteolize in sistem za ojačanje ultrazvočnega signala na podlagi proteinskih plinskih veziklov, ki ojača vnos Ca2+ v sesalske celice. Za uravnavanje vnosa Ca2+ smo se naslonili na proteinski par, ki uravnava založno reguliran vnosa kalcija: STIM1 in Orai. Na osnovi aktivne domene proteina STIM1 in ovitih vijačnic smo pripravili protein imenovan PACE, ki se aktivira ob proteolitski cepitvi. Aktivacija proteina vodi do vnosa Ca2+ ionov v citosol preko kanalov Orai. Dosežena koncentracija Ca2+ ionov preko kalmodulina in kalcinevrina povzroči jedrni vnos umetnih, od kalcija odvisnih, transkripcijskih faktorjev in izražanje tarčnih genov. Na podlagi prvotnega proteina PACE smo pripravili tudi različico, ki jo lahko aktivirata dve različni proteazi. Z izražanjem proteina PACE in proteaz, ki se aktivirajo z majhnimi molekulami v T celicah smo pokazali, da lahko nadziramo vnos Ca2+ in izražanje citokinov IL2 in TNF?. Drugačen pristop k ojačanju vnosa Ca2+ v celico smo ubrali z uporabo proteinskih plinskih veziklov. Plinski vezikli organizma Bacillus megaterium, ki jih lahko izražamo v bakterijah E. coli, se zaradi svoje votle strukture obnašajo ob akustični stimulaciji drugače kot sesalske celice. Zaradi te lastnosti lahko ojačajo z ultrazvokom povzročeno mehansko silo, ki povzroči odprtje kalcijevih kanalov na membrani. Da bi bolje razumeli sestavo proteinskih plinskih veziklov, smo z izbijanjem genov ugotovili, da proteini GvpR, GvpT in GvpU niso nujni za izgradnjo funkcionalnih veziklov. S pomočjo pretočne citometrije in krioelektronske mikroskopije smo ugotovili, da se protein GvpJ tesno veže na plinske vezikle, N končno sklapljanje proteina GvpN s fluorescenčnim proteinom pa povzroči, da plinski vezikli ne tvorijo cilindrične strukture in ostanejo vretenaste oblike. Z uporabo proteina GvpC iz genskega klastra organizma Anabaena flos aquae smo uspeli plinske vezikle pripeti na membrano sesalskih celic. Celice, ki so imele na površini plinske vezikle, so ob stimulaciji z ultrazvokom izražale več reporterskega proteina kot celice brez plinskih veziklov. Tako genetsko kodirani modificirani plinski vezikli kot tudi sintetični znotrajcelični ojačevalci so novo razvito orodje za povečanje občutljivosti na blage mehanske dražljaje. Njihova aktivnost podaljša trajanje in poveča amplitudo citosolnega Ca2+ in s tem posledično poveča aktivacijo transkripcijo sintetičnih genov.20232023-12-02 07:15:50Doktorsko delo/naloga152644sl