Kloniranje in izražanje bakteriofagnih endolizinov ter proteinskih vezalcev toksinov Clostridioides difficileCelan, Zala (Avtor) Bratkovič, Tomaž (Mentor) Bozovičar, Krištof (Komentor) afimeriClostridioides difficilečiščenjeDARPiniendoliziniizražanjevezalci eksotoksinovZdravljenje okužbe z bakterijo Clostridioides difficile zaradi odpornosti proti antibiotikom predstavlja veliko problematiko v sodobnem svetu. Do okužb prihaja zlasti v bolnišničnem okolju ob uporabi antibiotikov, ki izzovejo spremembe v sestavi črevesne mikrobiote. C. difficile povzroča vnetja in krvavitve iz debelega črevesa (kolitis), ki vodijo v hudo obliko driske in se lahko končajo tudi s smrtjo. Poglavitna virulentna dejavnika C. difficile sta eksotoksina TcdA in TcdB, glukoziltransferazi, ki delujeta na GTPaze iz družine Rho, s čimer oslabita tesne in fokalne stike v sluzničnem epiteliju. Rekombinantni probiotiki predstavljajo bioalternativni protimikrobni pristop za zdravljenje okužbe s C. difficile in so tematika mnogih (pred)kliničnih raziskav. Okužbo s C. difficile bi lahko zmanjšali ali preprečili s kombinacijo uporabe bakteriofagnih endolizinov, selektivnih do C. difficile, in specifičnih proteinskih vezalcev toksinov TcdA ter TcdB, ki bi se izražali na površini rekombinantne probiotične bakterije Lactococcus lactis. V diplomski nalogi smo se osredotočili na pridobitev vezalcev toksinov (iz skupin afimerov in DARPinov; samih ali v fuziji s C-končno domeno sidrnega proteina AcmA, ki omogočajo vezavo na celično steno L. lactis,) ter endolizina z uporabo ekspresijskega sistema Escherichia coli. V prvem delu naloge smo pripravili ekspresijske vektorje: v modificiran plazmid pET28c (pET28c-HTF), smo vstavili sintezne gene za izbrane proteine. Ekspresijski sev E. coli NiCo21(DE3) smo transformirali s plazmidi in izvedli testno izražanje rekombinantnih proteinov po indukciji z IPTG ter s poliakrilamidno gelsko elektroforezo v prisotnosti natrijevega dodecilsulfata kvalitativno ocenili količino rekombinantnih produktov. Ugotovili smo, da vezalci eksotoksinov v fuziji z AcmA niso topni. Na podlagi rezultatov smo za izražanje v povečanem obsegu izbrali le topne proteine (tj. vezalce eksotoksinov brez AcmA in endolizina). V drugem delu diplomske naloge smo rekombinantne proteine izolirali s kovinsko-kelatno afinitetno kromatografijo ter jih koncentrirali z ultrafiltracijo. Ugotovili smo, da se fuzijski proteini vezalcev eksotoksinov TcdA/TcdB s sidrno domeno AcmA nahajajo v netopni frakciji lizata in se pri uporabljenih pogojih izražanja odlagajo v inkluzijska telesca.20232023-11-26 07:45:19Diplomsko delo/naloga152455sl