​Povezava genotipa in fenotipa paraoksonaze 1 s kognitivnim upadom pri bolnikih z nevrodegenerativnimi boleznimiPetrič, Boštjan (Avtor) Bavec, Aljoša (Mentor) Dolžan, Vita (Komentor) paraoksonaza 1Alzheimerjeva demencaParkinsonova bolezenkognitivni upadencimska kinetikaintegrirana Michaelis-Mentenina enačbalaktonazna aktivnostarilesterazna aktivnostparaoksonazna aktivnostOzadje: Encim paraoksonaza 1 (PON1) je prisoten v krvni plazmi, vezan na delce lipoproteinov visoke gostote (HDL) in ima antioksidativno vlogo. Njegovi fiziološki substrati niso dobro znani. Aktivnost PON1 v plazmi in polimorfizme (SNP) gena PON1 so preučevali pri blagi kognitivni motnji (BKM), pri Alzheimerjevi demenci (AD), in pri Parkinsonovi bolezni (PB). PON1 je prisoten tudi v cerebrospinalni tekočini (CSF), a so lastnosti PON1 v CSF in njegov kliničen pomen zaenkrat zelo slabo raziskani. Do sedaj pri človeku še niso raziskane encimsko-kinetične lastnosti PON1, t.j, Michaelis-Mentenini parametri Km, Vmax in kcat, ter njihov morebiten klinični pomen. Namen dela in hipoteze: V okviru doktorske naloge smo želeli preveriti, ali se značilnosti encima PON1 razlikujejo a) med PB bolniki s kognitivnim upadom in tistimi brez upada oziroma b) med bolniki z AD in tistimi z BKM. Želeli smo preveriti tudi, c) ali se značilnosti PON1 v CSF razlikujejo od PON1 v krvni plazmi. Obenem smo želeli razviti izboljšano metodo za določanje parametrov Km in Vmax iz krivulj poteka reakcije po času, ki bi jo lahko uporabili za meritve na omenjenih vzorcih. Postavili smo tri hipoteze: 1) Pri bolnikih z AD in BKM je aktivnost PON1 v cerebrospinalni tekočini povezana z aktivnostjo PON1 v serumu in je pri bolnikih z AD manjša kot pri bolnikih z BKM. 2) Pri bolnikih s Parkinsonovo boleznijo je aktivnost PON1 v serumu manjša v skupini s kognitivnim upadom, kot v skupini brez kognitivnega upada. 3) Izmerjena kinetična parametra, ki predstavljata fenotip PON1, sta boljši označevalec kognitivnega upada pri BKM, AD in PB od genotipa PON1. Metode: V klinično raziskavo smo vključili 231 bolnikov s PB, od katerih je za 207 bil jasen kognitivni status, in 161 bolnikov s sumom na AD/BKM, od katerih je 88 tudi imelo potrjen AD oz. BKM. Pri vseh bolnikih smo določili genotip za štiri pogoste SNP na genu PON1 ter kinetična parametra Km in Vmax za substrat dihidrokumarin (DHC) v krvni plazmi. Za vse bolnike iz AD skupine smo poleg tega z novo metodo na osnovi krivulj poteka reakcije po času določili še Km in Vmax za substrat fenilacetat (PA) tako v krvni plazmi kot v CSF ter začetno hitrost za substrat paraokson (PX) v krvni plazmi. Za bolnike s potrjeno AD ali BKM smo določili tudi koncentracijo PON1 z metodo ELISA. Rezultati: Razvili smo metodo za določanje kinetičnih parametrov, ki temelji na odstranjevanju odvečnih točk s krivulje poteka reakcije po času. Programsko kodo smo poimenovali iFIT ter javno objavili na spletu. Pokazali smo, da je iFIT primerljiv oziroma boljši od obstoječih metod. Pokazali smo, kateri SNP gena PON1 vplivajo na kinetične parametre za določen substrat ali na koncentracijo encima in pri katerih je ta vpliv verjetno zgolj navidezen oz. posledica vezave. Prisotnost PON1 v CSF smo potrdili pri vseh preučevanih vzorcih. Izkazalo se je, da med značilnostmi PON1 v krvni plazmi in v CSF ni nobene korelacije; p-vrednosti za primerjavo med koncentracijo encima, Km, Vmax in Vmax/Km za PA v CSF in ekvivalentnimi parametri v krvni plazmi so bile vse večje od 0.05. Prav tako nobeden od preučevanih SNP ni koreliral z nobenim od parametrov PON1 v CSF, čeprav so imeli taisti SNP izredno močno korelacijo z določenimi parametri v krvni plazmi. Zaznali nismo nobene korelacije med genotipom, koncentracijo PON1 ali kinetičnimi parametri na eni strani in kognitivnim statusom bolnikov iz katere od obeh skupin na drugi strani. Zaključek: Nobene od hipotez, ki so se vse nanašale na povezavo med PON1 in kognitivnim upadom ali med PON1 v plazmi in PON1 v CSF, nismo potrdili. Presenetljiv rezultat, da PON1 v CSF ne kaže korelacije z genetiko, s PON1 v plazmi ali s kognitivnim upadom, odpira veliko vprašanje, kateri so dejavniki, ki vplivajo na značilnosti PON1 v CSF. Odsotnost povezave med PON1 in kognitivnim statusom nakazuje, da PON1 ni perspektiven kot biološki označevalec, ki bi odražal kognitivno stanje. Uporaben rezultat je tudi program iFIT, katerega uporabnost smo pokazali tako na rekombinantnem encimu kot na vseh bioloških vzorcih.20232023-11-15 07:15:08Doktorsko delo/naloga152253sl