Vloga nabitih segmentov pri kanonični aktivaciji inflamasoma NLRP3Glavič, Kim (Avtor) Hafner Bratkovič, Iva (Mentor) Župunski, Vera (Komentor) NLRP3inflamasomlokalizacijaaktivacijanabiti segmentPrirojena imunost predstavlja prvo obrambno črto pred patogenimi organizmi. Do aktivacije določenih receptorjev naravne imunosti pa lahko pride tudi v odsotnosti mikrobov ali njihovih komponent. NLRP3 je citosolni senzor prirojene imunosti, ki omogoča zaznavo številnih patogenih in endogenih molekulskih vzorcev. Po aktivaciji z raznolikimi aktivatorji, NLRP3 oligomerizira in pritegne adapterski protein ASC ter efektorski protein prokaspazo 1, kar vodi v avtoproteolitično aktivacijo prokaspaze 1, ki nato cepi citokina pro-IL-1β in pro-IL-18 v njuno zrelo obliko. Substrat kaspaze 1 je tudi protein gasdermin D, čigar N-končni del tvori pore v membrani, kar vodi v celično smrt, imenovano piroptoza. Neuravnavano delovanje inflamasoma NLRP3 je povezano s številnimi kroničnimi vnetnimi, metabolnimi in nevrodegenerativnimi boleznimi. Mehanizem aktivacije inflamasoma NLRP3 še ni pojasnjen, a v zadnjih letih številne študije navajajo pomembnost celične lokacije NLRP3 pri aktivaciji. Nedavno so pokazali, da do sestavljanja inflamasoma NLRP3 lahko pride tudi na membrani razstavljenega trans-Golgijevega aparata, na katero naj bi se NLRP3 lokaliziral preko pozitivno nabitega segmenta NLRP3(127-130). Segment se nahaja v predelu NLRP3, ključnem za zaznavanje iztoka kalijevih ionov, ki je skupen celični dogodek številnih kanoničnih aktivatorjev NLRP3. Ker je nejasno, kakšen je mehanizem aktivacije inflamasoma NLRP3, in ali k temu prispeva tudi celična lokacija proteina, smo želeli opredeliti vlogo segmenta NLRP3(127 130) pri aktivaciji različno lokaliziranih NLRP3. Da bi pojasnili, ali je vloga segmenta NLRP3(127-130) pomembna le za lokacijo NLRP3 ali tudi za primeren odziv na aktivatorje, smo pozitivno nabit segment NLRP3(127-130) pri predhodno pripravljenih konstruktih NLRP3, ki omogočajo lokalizacijo na različne organele, mutirali v zaporedje štirih alaninov in pripravljene konstrukte stabilno vnesli v makrofage z izbitim genom za NLRP3. Ugotovili smo, da aktivacija umetno lokaliziranih variant NLRP3 poteče kljub prisotnosti mutacije 4×A, medtem ko uvedba enake spremembe v nelokaliziranem NLRP3 onemogoči njegovo aktivacijo. Omenjena mutacija nima vpliva na aktivnost konstitutivno aktivnih variant NLRP3. V okviru magistrskega dela smo ugotovili, da segment NLRP3(127-130) ne vpliva na zmožnost aktivacije lokaliziranega NLRP3 ob stimulaciji z različnimi aktivatorji kanonične poti. Vloga pozitivnega segmenta NLRP3(127-130) je pretežno v vezavi NLRP3 na organele, pri čemer pride do povečanja koncentracije molekul NLRP3, kar omogoči nadaljnje korake aktivacije.20232023-11-07 10:15:01Magistrsko delo/naloga152129sl