Transformacija bakterij Campylobacter jejuni z genom za luciferazo in priprava sevov mutant z izbitimi geni vključenimi v tvorbo biofilmaČukajne, Tjaša (Avtor) Klančnik, Anja (Mentor) Berlec, Aleš (Komentor) Campylobacter jejuniluciferaza NanoLucbioluminiscencakvantifikacija bakterijadhezijabiofilmizbitje genovPatogene bakterije vrste Campylobacter jejuni so že vrsto let glavni povzročitelj bakterijskega gastroenteritisa pri ljudeh po vsem svetu. Velik problem predstavljajo biofilmi, ki jih tvorijo na površinah v živilsko predelovalni industriji, saj jim omogočajo preživetje kljub neugodnim razmeram v okolju. Posledično so biofilmi glavno tveganje za širjenje bakterij C. jejuni v prehranjevalni verigi. Študije biofilmov so ključnega pomena za razumevanje odpornosti bakterij in razvoj novih strategij za obvladovanje bakterijskih okužb. Pomemben je razvoj novih, hitrih, specifičnih in ponovljivih metod za odkrivanje in kvantifikacijo bakterij v biofilmih. To je še posebnega pomena za bakterije C. jejuni, saj lahko neugodne razmere v okolju preživijo v živi, vendar ne kultivabilni obliki. V magistrskem delu smo oblikovali plazmid pMW10_nLuc s konstitutivnim izražanjem luciferaze NanoLuc. Plazmid smo uspešno transformirali v bakterijo C. jejuni in vpeljali novo specifično in ponovljivo metodo kvantifikacije bakterij z merjenjem bioluminiscence. Vpeljano metodo smo uporabili za kvantifikacijo planktonskih celic in določanje adhezivnosti ter filmotovornosti bakterij tako na polistirenski površini, kot tudi na površini prevlečeni z mucinom. Vpeljano metodo smo primerjali z metodo kvantifikacije kultivabilnih celic preko štetja kolonijskih enot, metodo kvantifikacije živih celic z resazurinom in barvanjem biomase biofilma s kristal vijoličnim. Specifičnost vpeljane metode smo dokazali v mešani kulturi s sevom Salmonella enterica, uporabnost pa v razmerah in vitro v modelu govejega fecesa in v piščančjem soku kot modelu živila. Razvito metodo kvantifikacije planktonskih celic in določanja adhezivnosti ter filmotvornosti smo uporabili tudi po tretiranju celic z antibiotikom ciprofloksacinom in tremi naravnimi protiadhezivnimi snovmi (epigalokatehin galat, karvakrol, timol). Vpeljana metoda predstavlja pomemben korak pri hitrejši in bolj celoviti kvantifikaciji adheriranih celic C. jejuni na površini in v biofilmu. Poleg tega smo uspešno pripravili seva mutant z izbitima genoma Cj0794 in Cj0736, ki sta domnevno pomembna pri tvorbi biofilma bakterij C. jejuni.20232023-10-18 07:15:52Magistrsko delo/naloga151711sl