Določitev vzročnih genetskih različic pri prirojeni eritrocitozi s sekvenciranjem naslednje generacije in funkcionalna opredelitev izbranih različicKristan, Aleša (Avtor) Debeljak, Nataša (Mentor) Preložnik Zupan, Irena (Komentor) eritrocitozasekvenciranje naslednje generacije (NGS)genetske različicefunkcionalna analizaeritropoezametabolizem železaUvod: Eritrocitoza je bolezensko stanje, pri katerem pride do povečanega števila eritrocitov, kar sovpada s povišanimi vrednostmi hemoglobina in/ali hematokrita v krvni sliki. Najpogostejši vzroki za eritrocitozo so pridobljeni, medtem ko je prirojena eritrocitoza redka oblika z znanimi vzroki v devetih različnih genih (EPOR, VHL, EGLN1, EPAS1, EPO, HBB, HBA1, HBA2 in BPGM), ki povzročajo osem različnih tipov prirojene eritrocitoze (ECYT 1-8). Zaradi raznolike etiologije je diagnostika eritrocitoze zahtevna, vzrok pa v večini primerov ostaja idiopatski. Molekularno-genetska diagnostika prirojene eritrocitoze v Sloveniji do sedaj še ni bila uveljavljena, zato je veliko bolnikov s sumom na prirojeno eritrocitozo ostalo brez potrjenega genetskega vzroka in v nekaterih primerih so bili tudi neustrezno zdravljeni. Cilji: Namen raziskave je bil poiskati genetski vzrok, povezan z razvojem eritrocitoze, pri slovenskih bolnikih, pri katerih obstaja sum na prirojeno eritrocitozo. Prav tako smo ocenili vpliv odkrite nove genetske različice na razvoj eritrocitoze. Metode: S sistematičnim pregledom literature in uporabo različnih in silico orodij za analizo molekularnih poti vključenih v eritropoezo, smo izbrali kandidatne gene in regije za tarčno sekvenciranje. Z novo vzpostavljenim nacionalnim diagnostičnim algoritmom je bilo opredeljenih 28 bolnikov s simptomi prirojene eritrocitoze, ki so bili vključeni v raziskavo, vključno s tremi družinami z dvema zdravima družinskimi članoma. Vzorci so bili analizirani s tarčnim sekvenciranjem naslednje generacije (NGS). Izbrana nova genetska različica je bila nadalje funkcionalno opredeljena z lokalizacijo različice na 3D strukturi proteina, analizo izražanja proteina s kvantitativnim prenosom western in analizo aktivnosti proteina z uporabo luciferaznega poročevalskega testa. Rezultati: Za tarčni NGS je bilo izbranih 39 genov, ki so povezani z eritrocitozo in presežkom železa v telesu. S tarčnim NGS 28-ih bolnikov smo odkrili eno znano patogeno različico v genu EPAS1, c.1609G>A (p.(Gly537Arg)), in štiri različice neznanega pomena (ang. variant of unknown significance, VUS) v genih EGLN1, JAK2, EPAS1 in SH2B3. V eni družini smo ugotovili tudi dve različici z nizko frekvenco v populaciji (< 5 %), v genih EGLN1 in JAK2. Poleg tega smo opazili visoko pojavnost prenašalcev patogenih različic v genu HFE. Različica c.1072C>T (p.(Pro358Ser)) v genu EGLN1 je ko-segregirala z boleznijo pri več družinskih članih, imela je visoko napoved patogenosti ter ni bila opisana v literaturi in klinični zbirki podatkov, zato je bila izbrana za dodatne funkcionalne analize. Lokalizacija na 3D strukturi proteina je pokazala, da se različica nahaja v aktivnem centru proteina in lahko vpliva na njegovo aktivnost. Rezultati kvantitativnega prenosa western so pokazali statistično pomembno (P < 0,0001) zmanjšano izražanje proteina EGLN1 z različico c.1072C>T (p.(Pro358Ser)), v primerjavi z nativnim proteinom. Oba rezultata nakazujeta na zmanjšano aktivnost EGLN1. Z luciferaznim poročevalskim testom nismo potrdili vpliva različice c.1072C>T (p.(Pro358Ser)) na zmanjšano aktivnost EGLN1. Zaključki: S tarčnim NGS smo uspešno potrdili genetski vzrok za eritrocitozo pri enem bolniku, prvem slovenskem bolniku s prirojeno eritrocitozo (ECYT4). Poleg tega smo identificirali štiri VUS v genih EGLN1, JAK2, EPAS1 in SH2B3, pri tem smo VUS v genu EGLN1 izbrali za nadaljnjo funkcionalno opredelitev. Rezultati funkcionalnih analiz so pokazali lokacijo različice v aktivnem mestu proteina EGLN1 in vpliv na izražanje proteina, ne pa tudi na aktivnost. Za opredelitev vpliva različice na delovanje proteina in nadaljnjo uravnavanje izražanja s hipoksijo induciblnih tarčnih genov so potrebne dodatne analize.20232023-10-18 07:15:38Doktorsko delo/naloga151710sl