Elektrokemijski encimski biosenzor v mikrofluidnem sistemuLokar, Nina (Avtor) Vrtačnik, Danilo (Mentor) biosenzor na čipuelektrokemijski biosenzorencimska in situ imobilizacijatankoplastna referenčna elektrodananostrukturiranje elektrodefizikalni model biosenzorjaAChE biosenzorglukozni biosenzorV disertaciji je predstavljen razvoj elektrokemijskega encimskega biosenzorja na čipu za merjenje glukoze ali eserina kot inhibitorja acetilholinesteraze (AChE). Za izdelavo in karakterizacijo tovrstnega senzorja potrebujemo interdisciplinaren pristop. Združiti je treba znanja elektrokemije, encimske kinetike in mikrofluidike. Glavne prednosti biosenzorjev so merjenje na izbrani lokaciji in ob izbranem času. Uporaba in postopki analize so poenostavljeni, zato se ne potrebuje posebej izučenega osebja. Biosenzorje lahko uporabimo tudi za preliminarne analize, pred izvedbo zahtevnejših in dragih analiz. Kot nova eksperimentalna tehnika pa se v zadnjem obdobju uporablja mikrofluidika, ki omogoča nadgradnjo biosenzorskih sistemov. Dodana vrednost je v uporabi izrazito majhnih količin vzorca in reagentov, možnost izvedbe več različnih eksperimentov hkrati in v kratkem času, možnost avtomatizacije eksperimentov in možnost hitrega prilagajanja števila procesnih enot. Delovanje biosenzorja temelji na biokemijskih in fizikalnih procesih, ki jih lahko opišemo s transportom analita v mikrokanalu, encimsko kinetiko in kronoamperometrijo. Fenomene sem združila v osnovnem modelu na primeru biosenzorja, ki je osnovan na encimu pirolokinolinski kinon-glukoza dehidrogenaza B (PQQ-GdhB). Sistem je rešen numerično z uporabo diferenčne metode za aproksimativno reševanje parcialnih diferencialnih enačb. Rešitev je odziv senzorja na različne koncentracije glukoze. V svojem delu poročam o dveh izvedbah eksperimentov – biosenzor v rezervoarju in biosenzor v mikrofluidnem sistemu. Poleg tega je senzor elektrokemijski. Kot pretvorniški del biosenzorja smo imeli tri-elektrodni sistem. V primeru biosenzorja v rezervoarju je bila delovna elektroda (WE) zlata tankoplastna, pomožna elektroda (CE) platinasta žička, ki je bila ovita okoli referenčne elektrode (RE) – miniaturne Ag/AgCl v KCl. V primeru biosenzorja v mikrofluidnem sistemu, pa so bile vse tri elektrode tankoplastne. Preklop med pristopoma se lahko izvede v nekaj minutah, saj je osnovni čip z WE na stekleni podlagi enak. Za prvi način so značilne statične meritve, za drugi pa poleg statičnih tudi dinamične. Biosenzor v rezervoarju sem uporabila za optimizacijo ključnih korakov pri razvoju biosenzorja, kot je ocena čistosti tankoplastnih zlatih elektrod, določitev ustrezne metode nanašanja mešanega enosloja samoorganiziranih molekul (SAM), pa tudi za določanje stabilnosti in shranjevanja biosenzorja. Poleg različnih eksperimentalnih načinov sem uporabila tudi t.i. velike in majhne elektrode. Pri velikih elektrodah je premer WE enak 3,0 mm, pri majhnih pa 0,8 mm. V primeru mikrofluidnega biosenzorja sem uporabila tudi mikrokanale, katerih oblike so bile prilagojene glede na oblike elektrod. Dolžina in višina sta bili 19,5 mm in 100 m za obe elektrodi. Za večje elektrode so bili kanali široki 6,7 mm, za manjše pa 1,2 mm. Tankoplastne elektrode so bile izdelane po standardnih postopkih naprševanja tankih plasti, fotolitografskih postopkih in postopkih jedkanja. Poleg zlate WE in CE, smo izdelali tudi RE Ag/AgCl, ki smo jo izdelali po kemijskem in elektrokemijskem postopku. Najbolj primeren način za nadaljni razvoj biosenzorja se je izkazala metoda s kapljičnim nanosom FeCl3, pri kateri se zgornje plasti srebrne elektrode pretvorijo v AgCl plast. Začetni korak pri izdelavi zanesljivega elektrokemijskega biosenzorja pa je poleg izdelave elektrod efektivno čiščenje le teh. Preizkusili smo kemijsko čiščenje z raztopino »piranhe«, elektrokemijsko čiščenje z žvepleno kislino in čiščenje elektrod s kisikovo plazmo. S prilagojenimi parametri se je slednje izkazalo kot najprimernejše za naš biosenzor, saj omogoča čisto površino z najmanjšo degradacijo nanesene plasti Ag/AgCl. Indikatorji čistosti so bili: potencialna razlika med katodnim in anodnim vrhom cikličnega voltamograma po čiščenju je bila 90 mV, vrhovi redukcije in oksidacije cikličnih voltamogramov so linearno sledili kvadratnemu korenu hitrosti preleta, količnik vrhov anodnega in katodnega toka pa je bil v povprečju enak 0,98. Poleg tega smo pri tankoplastnih elektrodah preizkušali tudi možnosti nanostrukturiranja WE, z namenom večje efektivne površine, s tem pa visoke občutljivosti. Za nanostrukturiranje smo uporabili HAuCl4 in NH4Cl in pulzne amperometrične tehnike. Izdelane nanostrukture smo opazovali z vrstično elektronsko mikroskopijo. Opazili smo igličaste skupke v velikosti 10 mm, z velikostjo posameznih iglic 500 nm. Efektivno površino elektrode, določeno s pomočjo ciklične voltametrije in Randles-Ševčik-ove enačbe, smo z nanostrukturiranjem uspeli povečati za 41%. Vsi nadaljni koraki izdelave biosenzorja so bili izvedeni samo na planarnih elektrodah. Prepoznavni del biosenzorja je v primeru detekcije glukoze PQQ-GdhB in v primeru detekcije eserina AChE. PQQ-GdhB je na zlato elektrodo imobiliziran s pomočjo 6-merkapto-1-heksanol (6-MCH) in 11-merkaptundekanojska kislina (11-MUA), ter 1-etil-3-karbodiimid hidroklorid (EDC) in sulfo-N-hidroksisulfosucinimid (S-NHS). AChE je na zlato elektrodo imobiliziran s pomočjo cisteamina in glutaraldehida. Za imobilizacijo encima na elektrodo sem uporabila dva načina. Enostavnejši način je potapljanje celotnega elektrodnega čipa v raztopine. Postopek je nezahteven in ne potrebuje dodatnih komponent, vendar ni selektiven in je počasen. Razvit način je mikrokontaktno tiskanje, ki se izvede s t.i. štampiljko iz polidimetilsiloksan-a (PDMS). Pri tem je depozicija molekul lokalna, samo na WE. Poleg tega se čas depozicije skrajša na nekaj minut. Prednost je tudi, da v kasnejših korakih izdelave mikrofluidnega biosenzorja omogoča in situ imobilizacijo, t.j. imobilizacija encima znotraj mikrokanala, kjer je biosenzor pozicioniran. Ta korak se izvede tik pred uporabo biosenzorja. Na ta način tudi ohranimo biološko aktivnost encima v največji možni meri. Učinkovitost izboljšane metode smo preverili elektrokemijsko in opazili zelo dobro pokritost WE z minimalno kontaminacijo RE in CE. Mikrofluidni del biosenzorja je izdelan po standardnih fotolitografskih postopkih, postopkih jedkanja in postopkih t.i. mehke litografije z uporabo elastomera PDMS. Mehanizem delovanja PQQ-GdhB biosenzorja temelji na oksidaciji glukoze, pri čemer se glukoza ob GdhB spremeni v glukonolakton, ob tem pa se odcepita dva elektrona, ki nato preideta na kofaktor PQQ, od tam pa na mediator. Le ta ponese elektrona do elektrode, kjer jih kronoamperometrično detektiramo. Pomagamo si lahko tudi s ciklično voltametrijo. Mehanizem delovanja AChE biosenzorja pa temelji na hidrolizi acetiltioholin klorid (ATCl). Produkt reakcije je tioholin klorid (TChCl), ki odda elektron mediatorju, le ta ga prenese do elektrode. Ker pa nas zanima koncentracija inhibitorja, ki inhibira encim, določimo inhibicijo z izmerjenim signalom v odsotnosti in prisotnosti eserina. Eksperimenti kažejo, da ima izdelan mikrofluidni elektrokemijski PQQ-GdhB biosenzor merilno območje do 10 mM koncentracije glukoze, linearno območje je do 200 M. Spodnja meja detekcije je pri tem 30 M. Biosenzorski odziv sledi Michaelis-Menten-ovi kinetiki. Michaelisova konstanta je določena kot 3,0 mM in 1,5 mM v primeru velikih in majhnih elektrod. Občutljivost biosenzorja v linearnem delu je 0,79 nA/M/mm2 v primeru pretoka 20 L/min. Ocenili smo tudi stabilnost razvitega biosenzorja – po 11 dneh se je signal zmanjšal za približno 45%. Preliminarne meritve AChE biosenzorja, ki smo jih izvedli samo v rezervoarju, kažejo, da kronoamperometrični signal kot odziv na različne koncentracije glukoze sledi Michaelis-Mentenovi kinetiki, z Michaelisovo konstanto 2,6 mM. Pri tem je merilno območje prav tako zgoraj omejeno na 10 mM koncentracijo ATCl. Po izpostavitvi biosenzorja 25 M eserinu za 10 min je bila ugotovljena 70% inhibicija encima. Reaktivacija inihbiranega AChE je bila določena kot 0,016 min-1. Izmerjeni parametri so primerljivi z literaturo. Razvit pristop in situ imobilizacije encima se lahko skupaj s celotnim razvojem mikrofluidnega biosenzorja, ki je predstavljen v disertaciji, široko uporabi, npr. z drugimi biološkimi prepoznavnimi elementi. V osnovi je glukozni biosenzor zasnovan predvsem za spremljanje glukoze v farmacevtskih procesih, zato tudi nadaljna nadgradnja ponuja pot do neprekinjenega in časovno neodvisnega zaznavanja. Na drugi strani, je AChE biosenzor razvit z mislijo uporabe v biomedicini. Ob zamenjavi ali dodajanju še drugih gradnikov pa se lahko mikrofluidni sistem prilagodi še za druge aplikacije in področja. Sistem bi lahko uporabili tudi na področjih medicinske diagnostike, farmacije, prehrambene industrije, ekologije, varnosti in tudi še širše.20232023-10-13 07:15:06Doktorsko delo/naloga151623sl