Optimizacija postopkov za oceno velikosti genoma s pretočno citometrijo pri repatih dvoživkahVencelj Merc, Bronja (Avtor) Bizjak Mali, Lilijana (Mentor) Kladnik, Aleš (Komentor) velikost genomaUrodelapretočna citometrijavrednost CGenomi repatih dvoživk (Urodela) sodijo med največje genome tetrapodov - sama velikost genoma ima tudi pomemben vpliv na morfologijo, metabolizem, ekologijo in evolucijo repatcev. Tukaj predstavljamo optimiziran postopek za oceno velikosti genoma pri repatih dvoživkah s pretočno citometrijo. Metodo smo optimizirali na krvnih vzorcih španskega pupka (Pleurodeles waltl) in aksolotla (Ambystoma mexicanum), ter jo preizkusili na močerilu (Proteus anguinus). Pri optimizaciji metode pretočne citometrije smo primerjali različne pufre za liziranje celic in sproščanje jeder, primernost različnih pogosto uporabljenih fluorokromov za obarvanje jeder ter vpliv encima RNaza A na kvaliteto vzorcev pretočne citometrije. Kot ustrezen postopek priprave vzorcev za pretočno citometrijo smo določili 1) liziranje celic in sproščanje jeder v Galbraithovem pufru, 2) barvanje jeder s propidijevim jodidom v koncentraciji 100 µg/mL, brez potrebe po uporabi encima RNaze. Potrdili smo, da je A. mexicanum primeren interni standard za oceno velikosti genoma repatcev s pretočno citometrijo. Z našim postopkom pridobljene ocene velikosti genoma P. waltl so bile skladne z obstoječimi ocenami velikosti genoma te vrste, ter z meritvami velikosti genoma s slikovno citometrijo. Primerjali smo tudi štiri načine fiksacije krvnih vzorcev repatcev s časom fiksacije 7 in 14 dni. Za pretočno citometrijo so ustrezni vzorci, fiksirani v 3:1 v/v mešanici metanola in ocetne kisline. Postavljena metoda je nedestruktivna in zato primerna tudi za uporabo pri ogroženih vrstah dvoživk.[B. Vencelj Merc]20232023-10-01 07:16:41Magistrsko delo/naloga151221sl