Karakterizacija vezave proteina hnRNP H1 na heksanukleotidne ponovitve GGGGCCGnidovec, Luka (Avtor) Župunski, Vera (Mentor) hnRNP H1GGGGCCC9ORF72G-kvadrupleksidušenje fluorescencetermoforezaEMSAfazna ločba tekoče-tekočeAmiotrofična lateralna skleroza (ALS) je nevrodegenerativna bolezen, ki se kaže s postopno degeneracijo in izgubo motoričnih nevronov, kar vodi v progresivno mišično paralizo. Čeprav so pretekle raziskave razkrile številne genetske vzroke, molekularni mehanizmi bolezni ostajajo slabo raziskani. Ena najpogostejših kavzalnih mutacij v ALS je heksanukleotidna ekspanzija ponovitev GGGGCC (G4C2) v genu C9ORF72. Zaradi visoke vsebnosti gvaninov ima zaporedje sposobnost tvorbe raznolikih struktur, med drugim različnih tipov G-kvadrupleksov. Heksanukleotidna ekspanzija G4C2 bi lahko nevrodegeneracijo povzročila na različne načine. Spremenjene multivalentne interakcije heksanukleotidnih ponovitev z RNA-vezavnimi proteini bi lahko povzročile sekvestracijo le-teh v jedrne in citoplazemske granule, s čimer bi onemogočile njihovo fiziološko delovanje. Regulator izrezovanja intronov hnRNP H1 je eden izmed glavnih interaktorjev ponovitev G4C2. Najdemo ga tudi v jedrnih granulah, opaženih v s C9ORF72 povezanim ALS. Narava vezave hnRNP H1 na ponovitve G4C2 ni dobro razumljena. V okviru magistrskega dela smo želeli interakcijo raziskati s strukturnega vidika. Želeli smo ugotoviti, ali se hnRNP H1 preferenčno veže na linearno zaporedje ali na G-kvadruplekse. Poleg tega nas je zanimalo, če hnRNP H1 razvije G-kvadruplekse ob vezavi nanje. Z metodo kloniranja IVA smo pripravili vektorski konstrukt pMCSG7-hnRNPH1-MBP, ki smo ga uporabili za izražanje proteina v bakterijskih celicah. Protein smo nato izolirali z z uporabo nikljeve afinitetne kromatografije ter kromatografije z ločevanjem po velikosti. Po kromatografiji z ločevanjem po velikosti smo s proteazo TEV odcepili fuzijski partner MBP nato pa izvedli še heparinsko afinitetno kromatografijo, s čimer smo pridobili zadostno čist protein hnRNP H1 za nadaljnje interakcijske teste. Za določitev vezave proteina na zaporedje G4C2 v linearni obliki ali v obliki G-kvadrupleksov smo uporabili metodo termoforeze, ob tem pa izvedli še test dušenja fluorescence, s čimer smo preverili, če protein G-kvadrupleske ob vezavi razvije. Za ta namen smo uporabili DNA-oligonukleotid, ki je na 5'-koncu vseboval fluorofor Cy5, na 3'-koncu pa dušilec fluorescence BHQ2. Rezultati termoforeze in testa dušenja fluorescence kažejo na preferenčno vezavo hnRNP H1 na ponovitve G4C2 v linearni obliki. Vezave na G-kvadruplekse v teh testih nismo zaznali, kar je onemogočilo določitev sposobnosti hnRNP H1, da razvije njihovo strukturo. Za dodatno potrditev vezave smo uporabili test zamika elektroforezne mobilnosti, kjer smo uporabili s transkripcijo in vitro pripravljeno RNA z osmimi ponovitvami G4C2. Rezultati testa zamika elektroforezne mobilnosti namigujejo na tvorbo struktur z višjo molekulsko maso, kar bi lahko bila posledica fazne ločbe tekoče-tekoče.20232023-09-08 14:10:00Magistrsko delo/naloga149731sl