Proteinski inženiring dimernih oblik človeškega katepsina B s kombinacijo racionalnega pristopa in naključne mutagenezeRazdevšek, Miha (Avtor) Novinec, Marko (Mentor) katepsin Boligomerizacijaproteinski inženiringV naravi se večina proteinov nahaja v oligomerni, predvsem homodimerni ali homotetramerni obliki. To encimom omogoča zvišano lokalno koncentracijo aktivnih mest, kar pospeši pretvorbo substrata. Ta lastnost je pri večini proteinov evolucijsko ugodna in se ohranja. Še vedno pa obstajajo monomerni proteini, ki se spontano ne povezujejo v oligomerne komplekse. Eden teh je katepsin B, cisteinska proteaza z endo- in eksonukleazno aktivnostjo. V sklopu diplomske naloge smo želeli z racionalnim pristopom poiskati aminokislinske ostanke na proteinu, ki bi jih lahko mutirali in s tem omogočili oligomerizacijo naravno monomernega proteina. V prvem delu diplomskega dela smo s pomočjo bioinformatskih orodij in teoretično znanih podatkov identificirali aminokislinske ostanke zadnje površine, smiselne za spremembo z naključno saturacijsko mutagenezo. Izbrali smo tiste, ki so bili obrnjeni ven, torej iz interakcijske površine. V drugem delu smo želeli in silico določena potencialno mutagena mesta preveriti še in vitro. Z naključno saturacijsko mutagenezo smo uvedli mutacije na specifična mesta in preverili dimerizacijsko stanje s sistemom BACTH. Do homodimerizacije dveh prokatepsinov B je prišlo ob uvedbi mutacije Glu9Val. Do heterodimerizacije pa pri mutaciji mesta 15, kjer je bila na eni podenoti prisotna mutacija Pro15Gly, druga podenota je bil divji tip proteina. Na koncu smo za oba potencialna dimera in silico vizualizirali najbolj verjetno strukturo dimera. Prvi se je povezal prek spodnje, drugi pa prek zadnje površine proteina.20232023-09-08 12:30:00Diplomsko delo/naloga149721sl