Priprava heterodimera ektodomen proteinov EpCAM in Trop2Maučec, Ana (Avtor) Pavšič, Miha (Mentor) EpCAMTrop2heterodimerparalogaafinitetne oznakeEpCAM in Trop2 sta homologna transmembranska proteina, ki sta vpletena v procese diferenciacije in proliferacije, ter prispevata k celični adheziji, njuna vloga v celičnih procesih pa še ni v celoti pojasnjena. V medicini ju pogosto uporabljajo kot biološka označevalca in tarči zdravljenj karcinomov, saj sta ravno pri tej vrsti raka pogosto prekomerno izražena. Homodimerna paraloga sta si zelo podobna po zaporedju in zvitju in sta včasih prisotna na površini istih epitelijskih celic. Opisanih je bilo kar nekaj primerov paralognih homodimernih proteinov, ki med seboj lahko tvorijo tudi heterodimerne komplekse. Simulacije molekulske dinamike predvidene strukture heterodimera so nakazale na možnost nastanka takšnega kompleksa, interakcije med podenotama pa naj bi bile močne. Te izsledke smo želeli eksperimentalno ovrednotiti in pripraviti heterodimer in vitro. V ta namen smo pripravili rekombinantni ekspresijski vektor pFastBac Dual z zapisoma za zunajcelični del neglikozilirane mutante EpCAM s heksahistidinsko oznako in delno neglikozilirane mutante Trop2 s StrepII oznako. Rekombinantna proteina smo proizvedli v insektni celični liniji Sf9. Po izražanju smo v dveh zaporednih korakih izvedli izolacijo potencialnega heterodimera: najprej z nikljevo afinitetno kromatografijo in nato še z afinitetno kromatografijo Strep-Tactin. Po drugi stopnji izolacije v vezani frakciji, kjer smo v primeru nastanka pričakovali heterodimer, le-tega nismo zaznali. Njegova vezava na nosilec Strep-Tactin bi lahko bila otežena zaradi steričnih ovir ali nedostopnosti StrepII oznake, vendar po NaDS-PAGE analizi v nevezani frakciji nismo zaznali prisotnosti Trop2, torej to ni bil razlog. Po detekciji T2EX-StrepII s Strep-Tactinom-HRP v mediju in homogenizatu insektnih celic po izražanju, smo ocenili, da je raven izražanja T2EX-StrepII približno 120-krat nižja od ravni izražanja ngEpEX-His. V primeru, da heterodimer nastane, bi verjetno nastal v premajhnih količinah, da bi ga z našim pristopom lahko zaznali.20232023-09-07 12:00:00Diplomsko delo/naloga149574sl