Kloniranje in izražanje proteina SFPQPervanja, Ana (Avtor) Župunski, Vera (Mentor) SFPQizražanjeALSFTDSpojitveni faktor, bogat s prolini in glutamini (SFPQ), je protein, ki lahko interagira tako s proteini kot tudi z RNA in DNA. Posledično sodeluje pri mnogih procesih v celici in ima vse večji pomen v raziskavah, ki so povezane z nevrodegenerativnimi boleznimi. Cilj diplomske naloge je bil izraziti in izolirati protein SFPQ v taki količini in čistosti, ki bi omogočila nadaljnje eksperimente, npr. spremljanje nastanka parapeg in vitro. Pripravili smo vektorja pMCSG7-MBP-SFPQ (N-končna fuzija z MBP in His6) in pMCSG7-SFPQ (SFPQ brez fuzij). SFPQ smo nato izražali z izhodiščnim vektorjem pJ4M-SFPQ-MBP in z vektorjem pMCSG7-MBP-SFPQ. Fuzija s His6 je omogočila izolacijo proteina s pomočjo afinitetne kromatografije z imobiliziranimi kovinskimi ioni (IMAC). Konstrukt SFPQ-MBP se je razgradil že med izražanjem. MBP-SFPQ se je izražal v dovolj velikih količinah, a je pri postopkih izolacije prišlo do razgradnje. Z vektorjem pMCSG7-SFPQ smo izražali SFPQ brez fuzij in ga izolirali z dodatkom cinkovega klorida. Do proteolize je prišlo pri izražanju in/ali izolaciji. Sklepali smo, da je vzrok za razgradnjo proteina velik delež neurejene strukture, ki je zato bolj občutljiv na proteaze. Postopke bi morali optimizirati in zmanjšati aktivnost proteaz.20232023-09-07 11:28:30Diplomsko delo/naloga149561sl