Priprava in izolacija rekombinantnega proteina beta karboanhidraze rastline Arabidopsis thalianaKartal, Ena (Avtor) Taler-Verčič, Ajda (Mentor) beta karboanhidraza (βCA)jodmolekulsko kloniranjebakterijski ekspresijski sistemIMACO vlogi joda pri rastlinah še ni veliko znanega. V pravih količinah vpliva na povečanje biomase in hitrejše cvetenje, vendar je lahko v prevelikih količinah za rastline tudi toksičen. Jodirane proteine najdemo v različnih delih rastline, ni pa znano, kako vezava joda na proteine vpliva na njihovo funkcijo. Po pregledu literature smo izbrali encim karboanhidrazo, ki ga najdemo tudi v jodirani obliki. Namen našega dela je bila priprava zadostne količine rekombinantnega proteina, da bi lahko vzpostavili sistem testiranja encimske aktivnosti, pri katerem bi primerjali aktivnost med tako imenovanim nativnim in jodiranim proteinom. Karboanhidraza (angl. Carbonic anhydrase) je metaloencim s cinkovim ionom v aktivnem mestu, ki katalizira medsebojno pretvarjanje CO2 in HCO3- v procesu fotosinteze. Predvsem ga lahko najdemo v listih rastlin. Pri rastlinah so prisotne tri različne družine karboanhidraz: α, β in γ. Najbolj raziskani so encimi, ki spadajo v družino β. Prisotni so v listih v dveh izooblikah: βCA1 in βCA2. Aktivno obliko predstavlja dimer, pri katerem je v aktivnem mestu cinkov ion koordiniran z dvema ostankoma cisteina, enim ostankom histidina in molekulo vode. Ti encimi imajo pomembno vlogo tudi pri rasti rastlin, sintezi aminokislin in lipidov, hkrati pa zavirajo kratkotrajne spremembe pH v stromi kloroplastov, ki jih provzročijo spremembe svetlobe ter tako delujejo pri odzivu na stres. Zapis za izbrani protein smo vstavili v vektor pET-32b(+) tako, da smo mu na 5'-konec dodali kodirajočo regijo za heksahistidinsko oznako in prepoznavno mesto za proteazo TEV. Nato smo protein pripravili v bakterijskem ekspresijskem sistemu in ga z uporabo Ni-kelatne kromatografije (IMAC) delno očistili. Ugotovili smo, da je cDNA-knjižnica iz listov rastline A. thaliana ustrezna matrica za pripravo rekombinantne karboanhidraze, ter da lahko protein v bakterijah pripravimo v zadostnih količinah za nadaljne študije. Postopki so bili uspešni le v primeru βCA1, saj nam s PCR ni uspelo pripraviti zapisa za βCA2.20232023-09-06 13:00:00Diplomsko delo/naloga149341sl